Illuminaシステム用のCUT&Tag DNAライブラリー調製のプロトコール

次世代シーケンシング (NG-seq) は、CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) アッセイの下流の解析に使用できるハイスループットな手法であり、ゲノム全体にわたる標的DNAの濃縮の特定や定量が可能です。CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systemsキットは、IlluminaシステムプラットフォームでのNG-seq用の、マルチプレックス化したサンプルの調製に適しています。このキットは、最大96種類の異なるバーコードを標識したCUT&Tag DNAライブラリーの調製に使用可能であり、これらのライブラリーは、まとめて一回のシーケンシング反応で解析できます。本製品は、CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561を用いて作成されたCUT&Tag DNAサンプルや、ATAC-seqなどの他のタグメンテーションアッセイで作成されたDNAサンプルにも適しています。本製品は、SimpleChIP^® Chromatin IP Kits (#9003, #9005, #56383) を用いて作成されたChIP-DNAや、CUT&RUN Assay Kit (#86652) を用いて作成されたCUT&RUN DNAに適しません。

適合する試薬：

• CUT&Tag Assay Kit #77552
• CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561

適合しないアッセイキット：

• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
• SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
• SimpleChIP^® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
• SimpleChIP^® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
• CUT&RUN Assay Kit #86652
• DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
• Multiplex Oligos for Illumina Systems (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538
• Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580

必要な試薬

キットに含まれている試薬：

1. CUT&Tag PCR Master Mix #63228
2. CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems #84876
3. CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems #27488
4. CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems #55058
5. CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems #61793
6. CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems #70447
7. CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems #87803
8. CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems #26897
9. CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems #52106
10. CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems #71100
11. CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems #88112
12. CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems #23497
13. CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems #37884
14. CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems #50105
15. CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems #65909
16. CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems #84796
17. CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems #17160
18. CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems #29209
19. CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems #41919
20. CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems #54212
21. CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems #70020

キットに含まれない試薬：

1. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) またはSPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
2. 80%エタノール (用事調製)
3. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
4. 磁気ラック/スタンド
5. Agilent社のBioanalyzerシステムおよびAgilent High Sensitivity DNA Kit (5067-4626)
6. PCRチューブ (またはプレート) とPCR装置

CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systemsのプロトコール

SAFE STOP

これは、実験操作を中断する必要がある場合に、プロトコールを安全に中断できるポイントを示します。

I. ロープレックスでサンプルをプールする場合のガイドライン：

デュアルインデックスプライマー方式では、それぞれに8塩基のインデックス配列をもつ、2種類のプライマーを使用します。Index 7 primerは、P7シーケンスに隣接するインデックスを含み、一方、Index 5 primerは、P5シーケンスに隣接するインデックスを含みます。デュアルインデックスでは、シーケンスサンプルの両末端に固有のインデックスを付加します。12種類のIndex 7 primerと、8種類のIndex 5 primerとを組み合わせることで、最大96種類の異なるサンプルを固有にインデックス化することができます。

Illumina社のNG-seqプラットフォームでは、A/Cのシーケンスには赤色レーザー/LEDを、G/Tのシーケンスには緑色レーザー/LEDを使用しています。各サイクルにつき、赤と緑の両方のチャンネルで読み取り、適切な画像のレジストレーションを行う必要があります (すなわち、各サイクルでAかCが存在し、各サイクルでGかTが存在する必要があります)。インデックスリードのシーケンシングの際、この色のバランスが保たれていないと、失敗の原因となります。各インデックスのシーケンスをチェックして、各サイクルに対して赤と緑両方のチャネルでシグナルを持つインデックスが使用されているかどうかを確認してください。以下の例をご参照ください：

良い例
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer		Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer
Index 701	ATTACTCG	Index 503	CCTATCCT
Index 702	TCCGGAGA	Index 504	GGCTCTGA
Index 703	CGCTCATT	Index 505	AGGCGAAG
Index 704	GAGATTCC	Index 506	TAATCTTA
	✔✔✔✔✔✔✔✔		✔✔✔✔✔✔✔✔

悪い例
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer			Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer
Index 701	ATTACTCG	Index 502		ATAGAGGC
Index 702	TCCGGAGA	Index 504		GGCTCTGA
Index 703	CGCTCATT	Index 506		TAATCTTA
Index 704	GAGATTCC	Index 508		GTACTGAC
	✔✔✔✔✔✔✔✔			✔✔✘✔✔✘✔✘

下の表は、一緒にシーケンスすることができる、有効なインデックスの組み合わせの一部 (すべてではありません) を、リスト化したものです。

Plex	Illuminasシステム用のCUT&Tag Index 7 Primers	Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer
2	Index 701、Index 702 Index 703、Index 704 Index 705、Index 706 Index 707、Index 708 Index 709、Index 710 Index 711、Index 712	任意のIndex 5 Primer
3	Index 701、Index 702、Index 703 Index 703、Index 704、Index 705 Index 705、Index 706、Index 707 Index 707、Index 708、Index 709 Index 709、Index 710、Index 711	任意のIndex 5 Primer
4	Index 701、Index 702、Index 703、Index 704 Index 703、Index 704、Index 705、Index 706 Index 705、Index 706、Index 707、Index 708 Index 707、Index 708、Index 709、Index 710 Index 709、Index 710、Index 711、Index 712	任意のIndex 5 Primer
5-12	他のすべてのi7 Primerを含む (必要な場合)、有効な4プレックスのIndex 7の組み合わせ	任意のIndex 5 Primer
> 12	他のすべてのi7 Primerを含む (必要な場合)、有効なIndex 7 4-plexの組み合わせ	Index 501、Index 502およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 503、Index 504およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 505、Index 506およびその他のIndex 5 primer (必要な場合) Index 507、Index 508およびその他のIndex 5 primer (必要な場合)

その他の有効な組み合わせを下の表にまとめています。CUT&Tag Index 7 primerとCUT&Tag Index 5 primerの有効なセットを選択してください。CUT&Tag Index 7 primerとCUT&Tag Index 5 primerを組み合わせ、必要とするライブラリー数に応じて、PCRに必要なプライマーセットを選定してください。

12 サンプルのプール	(1) 4種類のIndex 7 primerのセット * 3種類のIndex 5 primerのセット (2) 3種類のIndex 7 primerのセット * 4種類のIndex 5 primerのセット (3) 6種類のIndex 7 primerのセット * 2種類のIndex 5 primerのセット
26 サンプルのプール	(1) 6種類のIndex 7 primerのセット * 4種類のIndex 5 primerのセット 上記に、任意の2種類のIndex 5 primer (上記の4種類以外) と組み合わせた任意のIndex 7 primerを追加 (2) 6種類のIndex 7 primerのセット * 5種類のIndex 5 primerのセット 30種類のprimerペアのうちの26種類を用いて、26種類のライブラリーを増幅

II. Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer:

各CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systemsは 30 µLの容量で提供されています。

製品	Index Primerのシーケンス	予期されるIndex Primerシーケンスリード
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 501 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	TATAGCCT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 502 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	ATAGAGGC
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 503 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	CCTATCCT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 504 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	GGCTCTGA
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 505 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	AGGCGAAG
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 506 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	TAATCTTA
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 507 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	CAGGACGT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 508 Primer	5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´	GTACTGAC

-s-はホスホロチオエート結合を示しています。

III. Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer:

各CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systemsは 20 µLの容量で提供されています。

製品	Index Primerのシーケンス	予期されるIndex Primerシーケンスリード
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 701 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	ATTACTCG
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 702 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCCGGAGA
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 703 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CGCTCATT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 704 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	GAGATTCC
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 705 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	ATTCAGAA
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 706 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	GAATTCGT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 707 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CTGAAGCT
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 708 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TAATGCGC
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 709 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	CGGCTATG
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 710 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCCGCGAA
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 711 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	TCTCGCGC
Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 712 Primer	5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´	AGCGATAG

-s-はホスホロチオエート結合を示しています。

IV. PCR反応の設定

実験開始前の準備：

• Illuminaシステム用のCUT&Tag Index PrimerおよびCUT&Tag DNA (または任意の他のタグメンテーションされたDNA) を室温で解凍します。軽く遠心分離し、チューブの側面からすべての液体を採取します。
• Index 7 primerとIndex 5 primerの有効な組み合わせが成されていることを確認してください。正しいプライマー選択が行われていかどうかの確認は、セクションIとIIを参照してください。

注意：クロスコンタミネーションを避けるために、チューブ間で異なるチップを使用することが重要です。30 µL未満のCUT&Tag DNAでアッセイを開始する場合は、DNAse不含の水を添加し、容量を最大30 µLにします。

1. 以下を、滅菌処理したPCRチューブまたはPCRプレートのウェルの1つに加えてください。各PCRチューブまたはウェルに、加えたCUT&Tag Index 5 primerとCUT&Tag Index 7 primerの情報を記録しておいてください。
    

   試薬	PCR反応1回分の分量 (70 μL)
   CUT&Tag DNA (または任意のタグメンテーションされた DNA)	30 µL
   CUT&Tag PCR Master Mix	35 µL
   Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 7 Primer (10 µM)	2.5 µL
   Illuminaシステム用のCUT&Tag Index 5 Primer (10 µM)	2.5 µL

2. ピペッティングで反応液を上下させて完全に混合し、スピンダウンしてチューブの側面またはウェルの液体をすべて収集してください。
3. 蓋をしたチューブをサーマルサイクラーにセットし、以下の条件でPCR増幅を行ってください：
    

   a.	ギャップフィリング	58°C、5 分間
   b.	ギャップフィリング拡張	72°C、5 分間
   c.	初期変性	98°C、30秒間
   d.	変性	98°C、10秒間
   e.	アニーリングおよび伸長	60°Cで11秒間
   	CUT&Tag1反応あたり20,000から100,000個の細胞を用いたサンプルに対しては、ステップｄおよびeを合計13サイクル繰り返してください。
   	CUT&Tag1反応あたり20,000個以下の細胞を用いたサンプルに対しては、ステップｄおよびeを合計14 - 16サイクル繰り返してください。
   	注意： PCRサイクルが過剰数であると、ライブラリーの多様性の低下や、NGSリードの重複率の上昇を引き起こす場合があります。
   f.	最終伸長反応	72°C、1分間
   g.	保持 (Hold)	4℃

4. PCR増幅産物のクリーンアップ (セクションV) に進んでください。(Safe Stop) サンプルを‐20℃で保存することもできます。

V. PCR増幅産物のクリーンアップ

実験開始前の準備：

• AMPure XP ビーズを使用する場合、室温に戻るよう使用前に少なくとも30分間は室温に置いてください。
• チューブの転倒混和またはピペッティングにより、AMPure XP BeadsまたはSPRIselectビーズを再懸濁してください。
• 1サンプルあたり、400 µLの80%エタノールを用意してください。
• 1サンプルあたり、20 µLの10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) を調製してください。

注意：ビーズを乾燥させ過ぎないでください。これにより、DNA標的の回収量が低下します。ビーズにまだ光沢があり、すべての液体が蒸発した状態で、サンプルを溶出してください。ビーズがひび割れしてきたら、それは乾燥し過ぎです。

注意：ヒストン修飾の解析用に調製されたCUT&Tag DNAライブラリーは通常、BioanalyzerまたはTapeStationシステム上で確かなシグナルを示しますが、転写因子やコファクターなどのヒストン以外のタンパク質の解析用に調製されたライブラリーは、BioanalyzerまたはTapeStationシステム上で非常に弱いシグナルを示すか、シグナルが全くみえない場合があります。そのような場合でも、高いマッピング率、多数の同定された結合ピーク、全ゲノムにわたる許容されるシグナル対ノイズ比を示すNG-seqの結果を取得できます。そのため、弊社はBioanalyzerまたはTapeStationシステムでシグナルが得られない、シグナルを示さない、転写因子やコファクターの解析用に調製したCUT&TagDNAライブラリーをシーケンシングに進めることを推奨します。

1. 再懸濁したAMPureビーズ 70 µL (1.0X) またはSPRIselectビーズを、セクションIVのステップ3で調製した70 µLのPCR反応液に加えてください。10回以上ピペッティングし十分に混合してください。チップ内の液体がすべて排出されるように、最後の混合は注意深く行ってください。
2. サンプルを実験台の上で少なくとも5分間、室温でインキュベートしてください。
3. 適切な磁気スタンドの上にチューブ/プレートを5分間置いて、上清とビーズを分離してください。
4. 上清を注意深く除去して捨ててください。標的のDNAを含むビーズを乱さないように注意しながら、残った液体をすべて除去してください。
5. 磁気スタンドに置いたまま、新しく調製した200 µLの80%エタノールをチューブ/プレートに加えてください。室温で30秒間インキュベートして、その後上清を注意深く取り除いて捨ててください。DNA標的を含むビーズを乱さないように注意してください。
6. ステップ5をもう一度繰り返し、合計2回洗浄してください。2回目の洗浄後、目に見えるすべての液体が取り除かれていることを確認してください。
7. チューブ/プレートを磁気スタンド上に置いた状態でフタを開け、ビーズを最大5分間風乾してください。
8. 磁気スタンドからチューブ/プレートを取り出してください。サンプルあたり17 µLの10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) を加え、ビーズから標的のDNAを溶出してください。ピペッティングで10回上下させて十分に混合してください。少なくとも2分間、室温でインキュベートしてください。
9. 磁気スタンド上にチューブ/プレートを5分間置いてください。注意深く、標的のDNAを含む上清15 µLを新しいチューブへ移してください。(Safe Stop) 使用するまで、DNAライブラリーを-20 °Cで保存できます。
10. NanodropまたはPicogreenアッセイで、ライブラリーDNAの濃度を測定してください。DNAライブラリー濃度は10 - 40 ng/µLの範囲内である必要があります。
11. ライブラリーDNA 1µLを、10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) で最終濃度が5 - 10 ng/µLになるように希釈してください。Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNAチップを使用し、メーカーの指示に従って、希釈済みライブラリーDNAのサイズ分布を解析してください。
12. ハイスループットシーケンシング用に、10 mM Tris-HCl (pH 8.0 - 8.5) で最終的な精製済みライブラリーサンプルを希釈してください。NG-seqに必要なライブラリーDNAの最適濃度と容量については、Illuminaのシーケンシングマニュアルを参照してください。