PathScan® Sandwich ELISA Antibody Pair プロトコール (ELISA-Pair)

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A 溶液および試薬

  1. 固相化バッファー: 1×PBS (20×PBS #9808)
    3.2 mM Na2HPO4、0.5 mM KH2PO4、1.3 mM KCl、135 mM NaCl、pH 7.4
  2. 洗浄バッファー: 1×PBS/0.05% Tween-20 (20×PBST #9809)
  3. ブロッキングバッファー: 1×PBS/0.05% Tween-20、1% BSA
  4. 1×細胞溶解バッファー: (10×Cell Lysis Buffer #9803)

    5. このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

    注意: CST社は使用直前に1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) の添加を推奨しています。

    • 20 mM Tris (pH 7.5)
    • 150 mM NaCl
    • 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)
    • 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)
    • 1% Triton X-100
    • 2.5 mM sodium pyrophosphate
    • 1 mM β-glycerophosphate
    • 1 mM Na3VO4
    • 1 µg/ml leupeptin
  5. TMB 基質: (TMB Substrate #7004)
  6. STOP 溶液: (STOP Solution #7002)

注意: 溶液は新しいものを使用してください。

B 固相化

  1. マイクロプレートを精製水ですすいでください。続いて精製水200 μLを加え、液を捨ててください。ウェルを乾燥させるため、ペーパータオルで水気をふき取ってください。
  2. 捕獲抗体をPBSで100倍に希釈してください。96ウェルプレート1枚分の場合は、捕獲抗体100 μLをPBS 9.9 mLに添加してください。十分に撹拌後、各ウェルに100 μLずつ加えてください。プレートに封をし、4℃で一晩 (17〜20時間) インキュベートしてください。
  3. 一晩固相化した後、ゆっくり封を外し、ウェルを洗浄してください:
    1. プレート内容物を容器に捨ててください。
    2. 各ウェルを洗浄バッファー200 μLで4回洗浄してください。洗浄毎に、各ウェル内の残留溶液を除去するために新しいタオルに叩きつけてください。ただし、ウェルを完全に乾燥させないでください。
    3. キムワイプですべてのウェルの裏側を拭いてください。
  4. プレートをブロッキングします。各ウェルにブロッキングバッファー150 μLを加え、プレートに封をし、37℃で2時間インキュベートしてください。
  5. ブロッキング後、ステップB3.と同様にプレートを洗浄し、プレートは使用可能になります。

C 細胞溶解物の調製

  1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 非変性状態で細胞を回収するため、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mL + 1 mM PMSFを加え、氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、適切なチューブに移してください。氷上に置いてください。
  5. 溶解物を氷上で超音波処理してください。
  6. 4℃で10分間遠心し、上清を新しいチューブに移してください。この上清が細胞溶解物で、1回の使用分ずつに小分けして、-80℃で保存してください。

D 操作手順

  1. 溶解物はそのまま、もしくはブロッキングバッファーで希釈して使用します。各ウェルに溶解物100 μLを加えてください。プレートに封をし、37℃で2時間インキュベートしてください。
  2. ステップB3.と同様に、プレートを洗浄してください。
  3. 検出抗体をブロッキングバファーで100倍に希釈してください。96ウェルプレート1枚分の場合は、検出抗体100 µLをブロッキングバッファー9.9 mLに添加してください。十分に撹拌後、各ウェルに100 µLずつ加えてください。プレートに封をし、37℃で一晩インキュベートしてください。
  4. ステップB3.と同様に、プレートを洗浄してください。
  5. 抗マウスまたは抗ウサギのHRP標識二次抗体をブロッキングバッファーで1,000倍に希釈してください。96ウェルプレート1枚の場合は、二次抗体10 µLをブロッキングバッファー9.99 mLに添加してください。十分に撹拌後、各ウェルに100 µLずつ加えてください。プレートに封をし、37℃で30分間インキュベートしてください。
  6. ステップB3.と同様に、プレートを洗浄してください。
  7. 各ウェルにTMB基質100 µLを加えてください。プレートに封をし、37℃で10分間インキュベートしてください。
  8. 各ウェルにSTOP溶液100 µLを加えてください。
  9. マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定してください。

posted January 2008

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