ELISA-Peptide Assay プロトコール (ELISA-P)

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A 溶液および試薬

1. 炭酸バッファー: 15 mM Na₂CO₃、35 mM NaHCO₃、0.2 g/L NaN₃ (pH 9.6)。炭酸バッファーに合成ペプチド1 μMを加えたものを使用します。
2. 10×PBS: NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.4 gおよびKH₂PO₄ 2.4 gを精製水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
3. 洗浄バッファー: 0.05% Tween-20を含む1×PBS (PBST)
4. ブロッキングバッファー: 10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) in PBST
5. 抗体希釈バッファー: 3% BSA in PBST
6. マウス一次抗体用DELFIA^®ユーロピウム標識抗マウスIgG、もしくはウサギ一次抗体用抗ウサギIgG (PerkinElmer Life Sciences社製、#AD0124)
7. DELFIA^® Enhancement溶液 (PerkinElmer Life Sciences社製、#1244-105)

(DELFIA^® は PerkinElmer, Inc.の登録商標です)

B プロトコール

1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに1 μM合成ペプチド加炭酸バッファー100 μLを加え、4℃で一晩もしくは37℃で2〜6時間インキュベートし、プレートにペプチドを固相化してください。ペプチドが結合あるいは吸着しない場合は、pH 4-8の他のバッファーで試してください。
2. 各ウェルを洗浄バッファー200 μLで3回洗浄してください。
3. 各ウェルにブロッキングバッファー200 μLを加え、37℃で1時間ブロッキングしてください。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄してください (必要に応じて、乾燥プレートを4℃で1-2ヵ月保存することも可能です)。
4. 抗体希釈バッファーで一次抗体を適宜希釈し、各ウェルに100 μLを加え、37℃で1時間インキュベートしてください。
5. 洗浄バッファーで3回洗浄してください。
6. 各ウェルに予め67 ng/100 μLになるように抗体希釈バッファーで希釈したDELFIA^®ユーロピウム標識抗マウスIgG 100 μLを加え、37℃で30分間インキュベートしてください。
7. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
8. Enhancement 溶液100 μLを加え、37℃で15分間インキュベートしてください。適切な時間分解プレートリーダーで615 nmの吸光度を測定してください。