表面マーカーで標識された末梢血のシグナル伝達を解析する代替プロトコール (Flow Alternate)

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A. 溶液および試薬

  1. 10×PBS: 1 L用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 14.4 gおよびKH2PO4 2.4 gを蒸留水に溶解し、HClでpH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
  2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. インキュベーションバッファー: BSA 0.5 g を 1×PBS 100 mL に溶解してください。4℃で保存してください。

B. 全血サンプルの調製 (固定、溶解、透過処理)

  1. 新鮮な全血100 μLをアッセイチューブに小分けしてください。
  2. オプション: 37℃水浴中のラックにアッセイチューブをセットし、リガンド、阻害剤あるいは薬剤等と短期処理してください。
  3. 各アッセイチューブに10%ホルムアルデヒドを65 μL加えてください。
  4. 手早くボルテックスし、15分間室温に置いてください。
  5. Tritonの最終濃度が0.1%になるようにPBSにTriton X-100 1 mLを添加してください。
  6. 再度ボルテックスし、30分間室温に置いてください。
  7. インキュベーションバッファー1 mLを加えてください。
  8. 遠心して細胞を沈殿させ、上清を吸引除去してください。
  9. 予冷した50%メタノール in PBSに細胞を再懸濁してください。使用するメタノールは、使用直前まで-20℃で保存してください。
  10. 氷上で少なくとも10分間インキュベートしてください。
  11. 染色操作に進んでください。染色操作を続けて行わない場合は、細胞を50%メタノールに浸し、-20℃で保存してください。

C. 非標識一次抗体と標識二次抗体を用いた染色

  1. 各アッセイチューブにインキュベーションバッファー1 mLを加え、遠心してすすいでください。繰り返してください。
  2. インキュベーションバッファーで適宜希釈した一次抗体を加えてください (希釈率については、各抗体のデータシートを参照してください)。
  3. 室温で30-60分間インキュベートしてください。
  4. 前述1. と同様に、インキュベーションバッファーで遠心し、すすいでください。
  5. メーカーの推奨に従ってインキュベーションバッファーで希釈した蛍光標識二次抗体＊に細胞を再懸濁してください。
  6. 室温で30分間インキュベートしてください。
  7. 前述1. と同様に、インキュベーションバッファーで遠心し、すすいでください。
  8. PBS 0.5 mLに細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで分析してください。

参照: Chow S, Hedley D, Grom P, Magari R, Jacobberger JW, Shankey TV (2005) Whole blood fixation and permeabilization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylated epitopes in leukocyte subpopulations. Cytometry A 67(1), 4–17.

推奨二次抗体：

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

Anti-Rat

(Alexa Fluor®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

posted November 2008

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