免疫蛍光染色 プロトコール (ビオチン標識抗体) (IF Biotin)

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*重要項目: 製品がこのプロトコールで使用できるかどうかをデータシートの APPLICATIONS で確認して下さい。

A 溶液および試薬

注意: 溶液は Milli-Q® もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 10×PBS: 1 L を用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 14.4 g および KH2PO4 2.4 g を精製水に溶解し、pH 7.4 に調整後、全量を 1 L にしてください。
  2. 16% ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences 社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存し、使用時に PBS で希釈してください。
  3. キシレン
  4. エタノール (無水変性、病理学グレード、100% および 95%)
  5. 蒸留水
  6. ブロッキングバッファー: 25 mL を用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、正常血清 (例: 正常ヤギ血清、正常ロバ血清) 1.25 mL と蒸留水 21.25 mL をよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 μL を加えてください。
  7. 抗体希釈バッファー: 40 mLを用意する場合は、10×PBS 4 mL を蒸留水36 mLに加えて混ぜ合わせてください。BSA 0.4 g を加え、溶解してください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 120 μL を加えてください。
  8. 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー: 1 L を用意する場合は、sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) 2.94 g を蒸留水 1 Lに溶解し、pH 6.0 に調整にしてください。
  9. 蛍光標識アビジン/ストレプトアビジン

注意: 一次抗体あるいは蛍光標識アビジン/ストレプトアビジンを初めてご使用の際は、至適希釈率を決めるために予備実験を行ってください。

  1. Prolong® Gold Antifade Reagent (Invitrogen社製、Cat# P36930)

(Milli-Q® は Millipore Corporation の、Prolong® は Molecular Probes, Inc. の登録商標です。)

B 試料作製

Ⅰ. 培養細胞株 (IF-IC)

重要事項: 製品が IF-IC に使用できるかどうかをデータシートの APPLICATIONS で確認して下さい。

注意: マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

  1. PBS で細胞をかるくすすいでください。
  2. PBS を吸引除去し、細胞が 2〜3 mm 浸る程の 2〜4% ホルムアルデヒド in PBS を加えてください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  1. 細胞を室温で15分間固定してください。
  2. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回すすいでください。
  3. メタノール透過化処理 (必要に応じて、データシート第一面を参照してください): ホルムアルデヒドで固定後、氷冷した100%メタノールで細胞を覆い (細胞が 3-5 mm 完全に浸る程の十分量のメタノールを使用し、細胞を絶対に乾かさないでください)、細胞をメタノール中で、-20℃、10分間インキュベートし、PBS で5分間すすいでください。
  4. 免疫染色操作 C に進んでください。

Ⅱ. パラフィン切片 (IF-P)

重要事項: 製品が IF-P に使用できるかどうかをデータシートの APPLICATIONS で確認して下さい。

脱パラフィン/再水和:

  1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
  2. 100% エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  3. 95% エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  4. 蒸留水で切片を各5分間、2回すすいでください。

抗原賦活化:

  1. 室温の 10 mM クエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) にスライドを浸してください。
  2. 水浴あるいは電子レンジを用いてクエン酸ナトリウムバッファー中でスライドを煮沸し、その後 95-99℃ を10分間維持してください。
  3. 実験台上でスライドを30分間冷ましてください。
  4. 蒸留水で切片を各5分間、3回すすいでください。
  5. PBS で切片を5分間すすいでください。
  6. 免疫染色操作C に進んでください。

Ⅲ. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

重要事項: 製品が IF-F に使用できるかどうかをデータシートの APPLICATIONS で確認して下さい。

注意: 作製したての凍結/未固定切片は、シグナルエピトープを保存するために下記方法で直ちに 2〜4% ホルムアルデヒドで固定してください。

  1. 4% ホルムアルデヒド in PBSで切片を覆ってください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  1. 切片を室温で15分間固定してください。
  2. PBS でスライドを各5分間、3回すすいでください。

C 免疫染色

注意: 乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

NOTE:ビオチンの発現レベルが内在的に高い組織あるいは細胞では、ステップ1の前にビオチン阻害キット (Endogenous Biotin-Blocking Kit、Invitrogen 社製、Cat. #E21390 など) のご使用が必要な場合があります。

  1. ブロッキングバッファーで試料を60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、一次抗体を抗体希釈バッファーで、データシートに示されている通りに希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体をアプライしてください。

注意: 二重標識用に、抗体希釈バッファーで適宜希釈した一次抗体の混合液を調製してください。

  1. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. PBS で各5分間、3回すすいでください。
  3. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識アビジン/ストレプトアビジンと、暗室、室温で30分間インキュベートしてください。
  4. PBS で各5分間、3回すすいでください。
  5. スライド上の細胞に Prolong® Gold Antifade Reagent を添加し、カバースリップで覆ってください。あるいは、マルチウェルプレート上の細胞を覆うのに十分な Prolong® Gold Antifade Reagent をアプライしてください。
  6. カバースリップの縁周りにマニキュア液を塗ってスライドを密封してください。
  7. 蛍光色素の最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4℃、暗所で、フラットに保存してください。

posted January 2009

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