免疫蛍光染色プロトコール (DOTMAC 透過処理) (IF DOTMAC)

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*重要項目: 製品がこのプロトコールで使用できるかどうかをデータシート第一面のAPPLICATIONSで確認してください。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液はMilli-Q^®もしくは同等の精製水で調製してください。

10×PBS: 1 Lを用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.4 gおよびKH₂PO₄ 2.4 gを蒸留水に溶解し、pH 8.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
16%ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存し、使用時にPBSで希釈してください。
Dodecyltrimethylammonium Chloride (DOTMAC) (>97.0%、TCI America社製、Cat#D1016)
蒸留水
ブロッキングバッファー: 25 mLを用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、二次抗体と同種の正常血清 (例: 正常ヤギ血清、正常ロバ血清) 1.25 mLと蒸留水21.25 mLをよく混ぜ合わせてください。
抗体希釈バッファー: 40 mLを用意する場合は、10×PBS 4 mLを蒸留水36 mLに加えて混ぜ合わせ、BSA 0.4 gを加えて溶解してください。
蛍光標識二次抗体 (推奨二次抗体)

注意: 一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体を初めてご使用の際は、至適希釈率を決めるために予備実験を行ってください。

(Milli-Q^®はMillipore Corporationの、Prolong^®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

重要事項: 製品がIF-ICに使用できるかどうかをデータシートのAPPLICATIONSで確認してください。

注意: マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

注意: 乾燥と蛍光色素退色の防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

注意: 二重染色する場合、抗体希釈バッファーで適宜希釈した一次抗体の混合液を調製してください。

注意: Alexa Fluor^®蛍光色素で直接標識された一次抗体を使用する場合は、ステップC10.に進んでください。

注意: 二重染色する場合、抗体希釈バッファーで適宜希釈した蛍光標識二次抗体の混合液を調製してください。

ステップC7.と同様に、PBSですすいでください。
スライド上の細胞にProlong^® Gold Antifade Reagentを添加し、カバースリップで覆ってください。あるいは、マルチウェルプレート上の細胞を覆うのに十分なProlong^® Gold Antifade Reagentをアプライしてください。
カバースリップの縁周りにマニキュア液を塗ってスライドを密封してください。
最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4℃、暗所で、フラットに保存してください。

推奨二次抗体：

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

Anti-Rat

(Alexa Fluor^®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

posted June 2010