PathScan^® Multiplex IF Kits －免疫蛍光染色プロトコール (IF)

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*重要項目: キットが培養細胞株 (IF-IC)、パラフィン包埋サンプル (IF-P)、あるいは凍結組織切片 (IF-F) で使用できるかどうかをデータシート第一面のAPPLICATIONSで確認してください。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液はMilli-Q^®もしくは同等の精製水で調製してください。

10×PBS: 1 Lを用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.4 gおよびKH₂PO₄ 2.4 gを蒸留水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
16%ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存し、使用時に加温したPBSで希釈してください。
ブロッキングバッファー (1×PBS/5% normal goat serum/0.3% Triton X-100): 25 mLを用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、正常ヤギ血清1.25 mLと蒸留水21.25 mLをよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 75 μLを加えてください。
抗体希釈バッファー (1×PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100): 25 mLを用意する場合は、10×PBS 2.5 mLを蒸留水22.5 mLに加えて混ぜ合わせてください。BSA 0.25 gを加え、溶解してください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 75 μLを加えてください。
Prolong^® Gold Antifade Reagent (Invitrogen社製、Cat# P36930)

パラフィン切片 (IF-P) 用試薬:

キシレン
エタノール (無水変性、病理学グレード、100%および95%)
抗原賦活化:
- クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー: 1 Lを用意する場合は、sodium citrate trisodium salt dihydrate (C₆H₅Na₃O₇•2H₂O) 2.94 gを蒸留水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
- EDTA: 1 mM EDTA: 1 Lを用意する場合は、EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 0.372 gを蒸留水に溶解し、pH 8.0に調整後、全量を1 Lにしてください。

(Milli-Q^®はMillipore Corporationの、Prolong^®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

注意: マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

注意: 下記手順の間、スライドを乾かさないように気をつけてください。

脱パラフィン/再水和:

抗原賦活化:

注意: 抗原賦活化液は製品により推奨が異なりますので、製品のデータシートを参照してください。

クエン酸の場合: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。実験台上でスライドを30分間冷却してください。
EDTAの場合: 1 mM EDTA (pH 8.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を15分間維持してください。冷却は必要ありません。

注意: 作製したての凍結/未固定切片は、シグナルエピトープを保存するために下記方法で直ちに4%ホルムアルデヒドで固定してください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

注意: 乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

posted July 2010