免疫組織染色プロトコール（凍結） - SignalStain^® Boost Detection Reagent

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*重要事項: 適切な抗体希釈液と抗原賦活化の手順は、各製品のデータシートを参照してください。

A 溶液および試薬

キシレン
エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
ヘマトキシリン (任意)
固定液: 最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。
1. 10%中性緩衝ホルマリン
2. アセトン
3. メタノール
4. 3%ホルムアルデヒド: 1×PBS 81.25 mLに16%ホルムアルデヒド18.75 mLを加えてください。
10×TBS: 1 Lを用意する場合は、Trizma^® base (C₄H₁₁NO₃) 24.2 gおよびNaCl 80 gを脱イオン水に溶解し、濃塩酸でpH 7.6に調整後、全量を1 Lにしてください。
洗浄バッファー: 1×TBS 1 Lを用意する場合は、10×TBS 100 mLを脱イオン水900 mLに加え、全量を1 Lにしてください。
メタノール/ペルオキシダーゼ: 30%過酸化水素10 mLをメタノール90 mLに加えてください。-20℃で保存してください。
ブロッキング液: 1×TBS/0.3% Triton-X 100/5%正常ヤギ血清: 1×TBS 9.5 mLに正常ヤギ血清500 µLおよびTriton-X 100 30 µLを加えてください。
検出システム: メーカーの取扱説明書に従って調製してください。CSTの検出システム（SignalStain^® Boost Detection Reagent）*もございます。
DAB試薬あるいは適切な基質: メーカーの推奨に従って調製してください。

(Trizma^®はSigma-Aldrich Biotechnology LPの登録商標です。)

組織は-80℃で保存してください: 切片を作製する前に冷凍庫から取り出し、-20℃で約15分間平衡化してください。これにより切片作製時の粗砕を防ぐことができます。
6-8 µmの範囲で組織を薄切し、プラスに帯電したスライドに貼り付けてください。
固定する前に切片を数分間実験台で風乾してください (これにより切片のスライドへの接着が促進されます)。

注意: 最適な固定液は、製品のデータシートを参照してください。

洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗浄してください。
メタノールで希釈した3%過酸化水素で、室温、10分間インキュベートしてください。
洗浄バッファーで切片を各5分間、2回洗浄してください。
ブロッキング液で各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体100-400 µLを各切片に添加してください。 (抗体は、ブロッキング液で希釈してください。) 4℃で一晩インキュベートしてください。 *一次抗体の推奨希釈率は、製品のデータシートを参照してください。
抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
メーカーの推奨に従い適切な検出システム*で検出してください。
洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
DABあるいは適切な基質100-400 μLを各切片に添加し、染色をしっかりと観察してください。

注意: DABは発がん性がありますので、必ず手袋を着用し、直接触れないようにしてください。

切片の染色が認められたら、すぐに脱イオン水に切片を浸してください。
必要に応じて、メーカーの取扱説明書に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
脱イオン水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
切片を脱水してください:
1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
カバースリップをマウントしてください。

*CSTの検出システム:

注意: この検出試薬でCSTが製品を最適化していない場合、最適希釈率の検討が必要な場合があります。

posted February 2010