免疫組織染色 プロトコール (パラフィン) (IHC / Paraffin)

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*重要事項: 適切な抗体希釈液と抗原賦活化の手順は、各製品のデータシートを参照してください。

A 溶液および試薬

  1. キシレン
  2. エタノール、無水変性、病理学グレード (100%および95%)
  3. 脱イオン水
  4. ヘマトキシリン (任意)
  5. 洗浄バッファー:
    1×TBS/0.1% Tween-20 (1×TBST): 1 Lを用意する場合は、10×TBS 100 mLを脱イオン水900 mLに加え、Tween-20 1 mLを添加後混合し、全量を1 Lにしてください。
    10×TBS: 1 Lを用意する場合は、Trizma® base (C4H11NO3) 24.2 gおよびNaCl 80 gを脱イオン水に溶解し、濃塩酸でpH 7.6に調整後、全量を1 Lにしてください。
  6. *抗体希釈液:
    1. SignalStain® 抗体希釈液 #8112
    2. TBST/5%正常ヤギ血清: 1×TBST 5 mLに正常ヤギ血清250 µLを加えてください。
    3. PBST/5%正常ヤギ血清: 1×PBST 5 mLに正常ヤギ血清250 µLを加えてください。
      1×PBS/0.1% Tween-20 (1×PBST): 1 Lを用意する場合は、10×PBS 100 mLを脱イオン水900 mLに加え、Tween-20 1 mLを添加後混合し、全量を1 Lにしてください。
      10×PBS: 1 Lを用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 14.4 gおよびKH2PO4 2.4 gを脱イオン水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
  7. *抗原賦活化液:
    1. クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー: 1 Lを用意する場合は、C6H5Na3O7•2H2O 2.94 gを脱イオン水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
    2. EDTA: 1 mM EDTA: 1 Lを用意する場合は、EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを脱イオン水に溶解し、pH 8.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
    3. TE: 10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 1 Lを用意する場合は、Trizma® base (C4H11NO3) 1.21 gおよびEDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを脱イオン水950 mLに溶解し、pH 9.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
    4. ペプシン: 1 mg/mLの割合でTris-HClに溶解し、pH 2.0に調整してください。
  8. 3%過酸化水素: 30% H2O2 10 mLを脱イオン水90 mLに加えてください。
  9. ブロッキング液: TBST/5%正常ヤギ血清: 1×TBST 5 mLに正常ヤギ血清250 µLを加えてください。
  10. ビオチン標識二次抗体
  11. ABC試薬: (Vectastain® ABC Kit、Vector Laboratories社製) 使用30分前にメーカーの取扱説明書に従って調製してください。
  12. DAB試薬あるいは適切な基質: メーカーの推奨に従って調製してください。

(Trizma®はSigma-Aldrich Biotechnology LPの、Vectastain®はVector Laboratoriesの登録商標です。)

B 脱パラフィン/再水和

注意: 操作の間、常にスライドを乾燥させないでください。

  1. 切片の脱バラフィン/水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  2. 脱イオン水で切片を各5分間、2回洗浄してください。

C *抗原賦活化

注意: 抗原賦活化液は製品により推奨が異なりますので、製品のデータシートを参照してください。

  1. クエン酸の場合: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。実験台上でスライドを30分間冷却してください。
  2. EDTAの場合: 1 mM EDTA (pH 8.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を15分間維持してください。冷却は必要ありません。
  3. TEの場合: 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を18分間維持してください。実験台上で30分間冷却してください。
  4. ペプシンの場合: 37℃で10分間処理してください。

D 染色

注意: 推奨の抗体希釈液は、製品のデータシートを参照してください。

  1. 脱イオン水で切片を各5分間、3回洗浄してください。
  2. 3%過酸化水素で切片を10分間インキュベートしてください。
  3. 脱イオン水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  4. 洗浄バッファーで切片を5分間洗浄してください。
  5. ブロッキング液100-400 μLで各切片を室温で1時間ブロッキングしてください。
  6. ブロッキング液を除去し、推奨の抗体希釈液で希釈した一次抗体100-400 μLを各切片に添加し、4℃で一晩インキュベートしてください。 *一次抗体の推奨希釈率は、製品のデータシートを参照してください。
  7. 抗体液を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  8. メーカーの推奨に従いTBSTで希釈したビオチン化二次抗体100-400 μLを各切片に添加し、室温で30分間インキュベートしてください。
  9. ABCアビジン/ビオチン法を使用する場合は、メーカーの取扱説明書に従ってABC試薬を調製し、室温で30分間インキュベートしてください。
  10. 二次抗体を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  11. ABC試薬100-400 μLを各切片に添加し、室温で30分間インキュベートしてください。
  12. ABC試薬を除去し、洗浄バッファーで切片を各5分間、3回洗浄してください。
  13. DABあるいは適切な基質100-400 μLを各切片に添加し、染色をしっかりと観察してください。

注意: DABは発がん性がありますので、必ず手袋を着用し、直接触れないようにしてください。

  1. 切片の染色が認められたら、すぐに脱イオン水に切片を浸してください。
  2. 必要に応じて、メーカーの取扱説明書に従ってヘマトキシリンで切片を対比染色してください。
  3. 脱イオン水で切片を各5分間、2回洗浄してください。
  4. 切片を脱水してください:
    1. 95%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
    3. キシレンで切片を各10秒間、2回インキュベートしてください。
  5. カバースリップをマウントしてください。

posted June 2005

revised February 2008

免疫組織染色 プロトコール (パラフィン) (IHC / Paraffin)

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