免疫沈降 プロトコール (変性タンパク質) (IP / Denatured)
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A 溶液および試薬
注意: 溶液は、Milli-Q®もしくは同等の精製水で調製してください。
- 変性用細胞溶解バッファー: 50 mM Tris (pH 7.5)、70 mM β-メルカプトエタノール (β-ME)。β-MEは、使用直前に添加し、予め10分間煮沸してください。
- 細胞溶解バッファー (1×): (10×Cell Lysis Buffer #9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na3VO4、1 μg/mL Leupeptin
注意: 使用直前に1 mM PMSFを添加してください。
- Protein Aアガロースビーズ: 1×PBS 5 mLをProtein Aアガロースビーズ1.5 gに加え、緩やかにかき混ぜながら4℃で2時間インキュベートしてください。遠心によりビーズを沈殿させ、PBSで沈殿物を2回洗浄後、1容量のPBSにビーズを再懸濁してください (ビーズは、4℃で2週間保存できます)。
- 3×SDSサンプルバッファー: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25℃)、6% w/v SDS、30%グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v ブロモフェノールブルー
(Milli-Q®は、Millipore Corporationの登録商標です。)
B 細胞溶解物の調製
- 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
- 変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、PBSで細胞を1回すすいでください。
- PBSを除去し、(使用直前に予め10分間煮沸した) 変性用細胞溶解バッファー0.4 mLを各プレート (150×25 mm) に加えてください。
- すぐにプレートから細胞をこすり落とし、2.5 mLチューブに移してください。
- 10分間煮沸してください。
- 4容量 (1.6 mL) の氷冷した1×細胞溶解バッファーを加えてください。これが細胞溶解物です。必要に応じて、溶解物は–80℃で保存できます。
C 免疫沈降
- 細胞溶解物200 μLに一次抗体を加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
- Protein Aアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液20 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で1-3時間インキュベートしてください。
- 4℃で30秒間遠心し、1×細胞溶解バッファー500 μLで沈殿物を5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
- 3×SDSサンプルバッファー20 μLに沈殿物を再懸濁し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
- サンプルを95-100℃で2-5分間加熱してください。
- SDS-PAGEゲル (12-15%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。
- ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。
posted June 2005