免疫沈降　プロトコール (非変性タンパク質) (IP / Native Protein)

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このプロトコールは、ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイによる解析用に非変性タンパク質を免疫沈降する際にご使用いただけます。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、逆浸透脱イオン水 (RODI) もしくは同等の精製水で調製してください。

1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLをRODI水950 mLに加え、撹拌してください。
2. 10×細胞溶解バッファー: (#9803) 1×細胞溶解バッファー1 Lを用意する場合は、10×細胞溶解バッファー100 mLをRODI水900 mLに加え、撹拌してください。
   注意: 使用直前に1 mM PMSFを添加してください。
3. Blue Loading Buffer Pack (SDS泳動バッファー): (#7722) 3×SDS泳動バッファーに1/10容量の30×還元剤　(1.25 M) を加え、3×還元用SDS泳動バッファーを用意してください。
4. Protein A あるいはG アガロースビーズ (#9007) (非標識一次抗体の場合): メーカーの取扱説明書に従って調製してください。ウサギIgG沈降にはProtein Aを、マウスIgG沈降にはProtein Gを使用してください (ビーズは4℃で2週間保存できます)。
5. 固定化ストレプトアビジン (ビーズ標識)(ビオチン標識抗体用): (#3419) 緩やかに抗体のバイアルをボルテックスし、免疫沈降1回につき10 μLを使用してください。
6. 10×キナーゼバッファー: (#9802) 1×キナーゼバッファー1 mLを用意する場合は、10×キナーゼバッファー100 μLをRODI水900 μLに加え、撹拌してください。
7. ATP (10 mM): (#9804) 200 μM ATP 0.5 mLを用意する場合は、10 mM ATP 10 μLを1×キナーゼバッファー490 μLに加えてください。

B. 細胞溶解物の調製

1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
5. 氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。
6. 14,000×g、4℃で、10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。必要に応じて、溶解物は–80℃で保存できます。

C. 免疫沈降

(非標識およびビオチン標識抗体用のオプションステップとして) 細胞溶解物を事前に洗浄する方法があります。

1. 1 mg/mLの細胞溶解物200 μLを分注し、(非標識一次抗体) Protein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液) 10-30 μL、あるいは (ビオチン標識抗体) ストレプトアビジンビーズ10 μLを加えてください。
2. 4℃で30-60分間インキュベートしてください。
3. 4℃で10分間遠心し、上清を新しいチューブに移してください。
4. 使用する一次抗体に応じて、適切な操作に進んでください。

非標識一次抗体の場合

1. 溶解物を14,000×g で1分間遠心してください。1 mg/mLの細胞溶解物200 μLを分注し、一次抗体を加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
2. Protein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液10-30 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で1-3時間インキュベートしてください。
3. 4℃で30秒間遠心し、沈殿物を1×細胞溶解バッファー500 μLで5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで沈殿物を解析する下記操作に進んでください。

ビオチン標識一次抗体の場合

1. 溶解物を14,000×g で1分間遠心してください。1 mg/mLの細胞溶解物200 μLを分注し、ビオチン標識抗体を加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
2. 緩やかにボルテックスし、(ビーズ標識) 固定化ストレプトアビジン (#3419) (10 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で2時間インキュベートしてください。
3. 4℃で30秒間遠心し、沈殿物を1×細胞溶解バッファー500 μLで5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
4. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで沈殿物を解析する下記操作に進んでください。

(ビーズ標識) 固定化抗体の場合

1. 溶解物を14,000×g で1分間遠心してください。緩やかにボルテックスし、1 mg/mLの細胞溶解物200 μLに固定化抗体 (10 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
2. 4℃で30秒間遠心し、沈殿物を1×細胞溶解バッファー500 μLで5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
3. ウェスタンブロッティングあるいはキナーゼアッセイで沈殿物を解析する下記操作に進んでください。

D. サンプルの解析

適切な操作に進んでください。

ウェスタンブロッティングによる解析の場合

1. 沈殿物を3×SDSサンプルバッファー20 μLに再懸濁し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
2. サンプルを95-100℃で2-5分間加熱処理し、14,000×gで1分間遠心してください。
3. SDS-PAGEゲル (4-20%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。
4. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。

注意: 分子量が50 kDaのタンパク質の場合、変性した重鎖によるマスキングを最小限にするために、二次抗体にはMouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677、あるいはMouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678 の使用をお勧めします。分子量が25 kDaのタンパク質の場合、Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678 をお勧めします。

キナーゼアッセイによる解析の場合

1. 1×キナーゼバッファー500 μLで沈殿物を2回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
2. 200 μM ATPと基質を添加した1×キナーゼバッファー40 μLに沈殿物を懸濁してください。
3. 30℃で30分間インキュベートしてください。
4. 3×SDSサンプルバッファー20 μLで反応を停止し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
5. リン酸化基質を含む上清を新しいチューブに移してください。
6. サンプルを95-100℃で2-5分間加熱し、14,000×g で1分間遠心してください。
7. SDS-PAGEゲル (4-20%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。