Immunoprecipitation Protocol / (For Analysis By Western Immunoblotting)

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A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q^®もしくは同等の精製水で調製してください。

1. 1×PBS
2. 1×細胞溶解バッファー: (10×Cell Lysis Buffer #9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na₃VO₄、1 μg/mL Leupeptin

注意: 使用直前に1 mM PMSFを添加してください。

3. 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
4. Protein AまたはGアガロースビーズ: メーカーの取扱説明書に従って調製してください。 ウサギIgG沈降にはProtein Aを、マウスIgG沈降にはProtein Gを使用してください (ビーズは、4℃で2週間保存できます)。
5. 3×SDSサンプルバッファー: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25℃)、6% w/v SDS、30%グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v ブロモフェノールブルー

(Milli-Q^®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B 細胞溶解物の調製

1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
5. 氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。
6. 14,000×g、4℃で、10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。必要に応じて、溶解物は–80℃で保存できます。

C 免疫沈降

オプション: Protein A/Gアガロースビーズへの非特異的結合を減らすために、溶解物を前洗浄する必要がある場合があります（下記を参照してください）。

1. 細胞溶解物200 μLに一次抗体を加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
2. Protein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液20 μL) を加え、緩やかに振盪しながら4℃で1-3時間インキュベートしてください。
3. 4℃で30秒間遠心し、1×細胞溶解バッファー500 μLで沈殿物を5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
4. 3×SDSサンプルバッファー20 μLに沈殿物を再懸濁し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
5. サンプルを95〜100℃で2-5分間加熱し、14,000×gで1分間遠心してください。
6. SDS-PAGEゲル (12-15%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。
7. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。

オプション: 細胞溶解物の前洗浄

1. 細胞溶解物200 μLにProtein AまたはGアガロースビーズ (50%ビーズ懸濁液20 μL) を加えてください。
2. 4℃で30-60分間インキュベートしてください。
3. 4℃で10分間遠心してください。新しいチューブに上清を移してください。
4. 免疫沈降のステップ1.へ進んでください。