Immobilized Immunoprecipitation Protocol / (For Analysis By Western Immunoblotting)

A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q®もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 1×PBS
  2. 1×細胞溶解バッファー: (10×Cell Lysis Buffer #9803) 20 mM Tris (PH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mM β-glycerophosphate、1 mM Na3VO4、1 μg/mL Leupeptin

注意: 使用直前に1 mM PMSFを添加してください。

  1. 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 mMグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
  2. 3×SDSサンプルバッファー: (#7722) 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25℃)、6% w/v SDS、30%グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v ブロモフェノールブルー

(Milli-Q®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B 細胞溶解物の調製

  1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー+ 1 mM PMSF混合液0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  5. 氷上で各5秒間、3回超音波処理してください。
  6. 14,000×gで4℃、10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。必要に応じて、溶解物は–80℃で保存できます。

C 免疫沈降

  1. 細胞溶解物200 μLに固定化抗体20 μLを加え、緩やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. 4℃で30秒間遠心し、1×細胞溶解バッファー500 μLで沈殿物を5回洗浄してください。洗浄は氷上で行ってください。
  3. 3×SDSサンプルバッファー20 μLに沈殿物を再懸濁し、ボルテックスした後、30秒間遠心してください。
  4. サンプルを95-100℃で2-5分間加熱し、14,000×gで1分間遠心してください。
  5. SDS-PAGEゲル (12-15%) でサンプル (15-30 μL) を電気泳動してください。
  6. ウェスタンブロッティングでサンプルを解析してください (ウェスタンブロッティングのプロトコールを参照してください)。

posted December 2007

Support