In-Cell Western プロトコール (In-Cell Western)

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A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q^®もしくは同等の精製水で調製してください。

10×PBS: NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.4 gおよびKH₂PO₄ 2.4 gを精製水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
16%ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存し、使用時にPBSで希釈してください。
ブロッキングバッファー: 25 mL用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、二次抗体と同じ種の正常血清 (例; 正常ヤギ血清、正常ロバ血清) 1.25 mLおよび蒸留水21.25 mLを加えて混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 µLを加えてください。
抗体希釈バッファー: 40 mLを用意する場合は、10×PBS 4 mLを蒸留水36 mLに加えて混ぜ合わせてください。BSA 0.4 gを加え、溶解してください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 120 μLを加えてください。
蛍光標識二次抗体

注意: 初めて一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体をご使用になる際は、至適希釈率を決めるために予備実験を行ってください。

(Milli-Q^®はMillipore Corporationの登録商標です。)

B 固定および免疫標識

注意: この固定プロトコールは、ほとんどの抗体と細胞株で使用できますが、各抗体/細胞株に最適な固定プロトコールを確認するために、さまざまな固定法を試すことをお薦めします。

注意: マルチウェルプレートで直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

注意: 各ウェル内の細胞の偏在による周縁効果を防ぐために、新たに細胞を播いたプレートを37℃インキュベーターに入れる前に、室温に1時間置いてください (詳細については、Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 2003 8, 566–70. を参照してください)。

注意: 散光とバックグラウンド蛍光からの擬似シグナルを最小にするために、黒色壁のマルチウェルプレート (例; BD Falcon社製、cat#353948) を使用してください。

注意: 定量に影響を及ぼす恐れがあるので、ピペットやアスピレーターでウェル内部を触れないでください。ウェルから液を除去する際には、廃液容器上でプレートを逆さにし、すばやく振って、清潔なペーパータオルで拭いてください。

注意: 下記には標準的な96ウェルプレート用の容量を記載しています。サイズの異なるプレートをご使用の際は、適宜容量を調整してください。

マルチウェルプレートで細胞を培養、処理してください。
各ウェルに4%メタノール不含ホルムアルデヒド in PBS 50 µLを加えてください。
細胞を室温で15分間固定してください。
アルデヒド廃液容器上でプレートを逆さにして振り、清潔なペーパータオルで拭いてください。
各ウェルを室温のPBS 100 µLで各5分間、3回すすいでください。
ブロッキングバッファー (50 µL/well) で細胞を室温で1時間ブロッキングしてください。
ブロッキング中に、一次抗体をIF-ICの推奨希釈率 (データシートに記載) に抗体希釈バッファーで希釈してください。
ブロッキング液を除去し、希釈した一次抗体を添加してください (総容量50 µL/well)。

注意: 二重標識する場合、適切な希釈率に抗体希釈バッファーで希釈したマウスおよびウサギの一次抗体の混合液を調製してください。

プレートに封をし、4℃で一晩インキュベートしてください。
プレートをPBSで各5分間、3回すすいでください。
抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体を加え (総容量50 µL/well)、室温、暗所で1時間インキュベートしてください。

注意: 二重標識する場合、抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識の抗マウスおよび抗ウサギの二次抗体の混合液を調製してください。

プレートをPBSで各5分間、3回すすいでください。
細胞数の標準化のため、PBSで1:1,000に希釈した#4084S DRAQ5^®　(総容量50 µL/well) で核標識してください。スキャニングの前に室温、暗所で少なくとも30分間インキュベートしてください。

注意: より良い結果のため、DRAQ5^®を完全に除去し、ウェルを少なくとも1回PBSで洗浄することも可能です。

メーカーの取扱説明書に従ってプレートを読み込んでください (読み込みの前にプレート底部が清潔な状態であることを確認してください)。

推奨二次抗体：

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

(DRAQ5^®はBiostatus Limitedの、DyLight^®はThermo Fisher Scientific Inc. の登録商標です。)

created November 2006

revised June 2010

In-Cell Western プロトコール (In-Cell Western)