PathScan® Sandwich ELISA プロトコール (Colorimetric) (Sandwich ELISA)

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A 試薬の調製

  1. 使用前に全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
  2. (PathScan® Sandwich ELISA Kitに含まれる) 20×洗浄バッファーをMilli-Q®もしくは同等の精製水で希釈し、1×洗浄バッファーを調製してください。
  3. 1×細胞溶解バッファー: (10×Cell Lysis Buffer #9803)

    4. このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

    注意: CST社は使用直前に1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) の添加を推奨しています。

    • 20 mM Tris (pH 7.5)
    • 150 mM NaCl
    • 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)
    • 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)
    • 1% Triton X-100
    • 2.5 mM sodium pyrophosphate
    • 1 mM β-glycerophosphate
    • 1 mM Na3VO4
    • 1 µg/ml leupeptin

(Milli-Q®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B 細胞溶解物の調製

  1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mL + 1 mM PMSFを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、適切なチューブに移してください。氷上に置いてください。
  5. 氷上で溶解物を超音波処理してください。
  6. 4℃で10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。上清が細胞溶解物です。溶解物は、1回分ずつに小分けし、–80℃で保存してください。

C 操作手順

  1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーに置いてください。使用しないマイクロウェルは、再封し、すぐに4℃で保存してください。
  2. 遠心用チューブに (各Pathscan® Sandwich ELISA Kitに入っている青色の) サンプル希釈液100 μLを加えてください。チューブに細胞溶解物100 μLを移し、数秒間ボルテックスしてください (推奨細胞溶解バッファーを細胞抽出に使用した場合、ウェルにアプライしたサンプルを1:1に希釈できます)。溶解物の適切な希釈係数とキットの分析結果に関する情報は、各キットの個々のデータシートに記載されています。
  3. 適切なウェルに希釈した各細胞溶解物100 μLを加え、テープで密封後、マイクロウェルの上からしっかりと押し付けてください。プレートを37℃で2時間インキュベートしてください。あるいは、プレートを4℃で一晩インキュベートすることで、標的タンパク質の最良の検出ができます。
  4. テープを優しくはがし、ウェルを洗浄してください:
    1. 容器にプレート内容物を捨ててください。
    2. 各ウェルを1×洗浄バッファー200 μLで4回洗浄してください。
    3. 洗浄毎に、新しいペーパータオルにプレートを叩きつけて、各ウェルに残っている溶液を除去してください。ただし、常にウェルを完全に乾燥させないでください。
    4. キムワイプで全てのウェルの裏側を拭いてください。
  5. 各ウェルに検出抗体 (緑色) 100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で1時間インキュベートしてください。
  6. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
  7. 各ウェルにHRP標識二次抗体 (赤色) 100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で30分間インキュベートしてください。
  8. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
  9. 各ウェルにTMB基質100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で10分間、もしくは25℃で30分間インキュベートしてください。
  10. 各ウェルにSTOP溶液100 μLを加えてください。数秒間緩やかにゆすってください。

注意: 陽性反応の最初の色は青色です。STOP溶液を加えることにより黄色に変わります。

  1. 結果を測定してください。
    1. 色別判定 — STOP溶液添加後、30分以内に結果を判定してください。
    2. 吸光度測定 — キムワイプでウェルの裏側を拭き、STOP溶液添加後、30分以内に450 nmの吸光度を測定してください。

posted June 2005

PathScan® Sandwich ELISA プロトコール (Colorimetric) (Sandwich ELISA)

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