ウェスタンブロッティング　プロトコール (Western)

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5% w/v 脱脂粉乳あるいはBSA、1×TBS、0.1% Tween-20で希釈した一次抗体と転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。

注意: 推奨する一次抗体希釈バッファーは製品により異なります。一次抗体希釈バッファーと希釈率は、各製品のデータシートを参照してください。

A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q®もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えてください。
  2. 1×SDSサンプルバッファー: (#7722、#7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25℃)、2% w/v SDS、10%グリセロール、50 mM DTT、0.01% w/v ブロモフェノールブルー、もしくはフェノールレッド
  3. 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
  4. 10×TBS: (#9997) 10×TBSを1 L用意する場合は、Tris base 24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、1×HClでpH 7.6に調整後、全量を1 Lにしてください。
  5. 脱脂粉乳: (#9999) (w/v)
  6. ブロッキングバッファー: 1×TBS、0.1% Tween-20 with 5% w/v 脱脂粉乳; 150 mL用意する場合は、10×TBS 15 mLを精製水135 mLに加え、脱脂粉乳7.5 gを溶解後、スターラーで撹拌しながらTween-20 (100%) 0.15 mLを加えてください。
  7. 洗浄バッファー: 1×TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)
  8. ウシ血清アルブミン (BSA): (#9998)
  9. 一次抗体希釈バッファー: 1×TBS、0.1% Tween-20 with 5% w/v 脱脂粉乳、あるいは5% BSA (脱脂粉乳とBSAのどちらを推奨するかは各製品のデータシートで確認してください); 20 mL用意する場合は、10×TBS 2 mLを精製水18 mLに加え、脱脂粉乳あるいはBSAを1.0 gを溶解後、スターラーで撹拌しながらTween-20 (100%) 20 μLを加えてください。
  10. Phototope®-HRP Western Blot Detection System: (anti-rabbit #7071)(anti-mouse #7072); ビオチン標識protein ladder (#7727)、HRP標識二次抗体(anti-rabbit #7074)(anti-mouse #7076)、HPR標識ビオチン抗体 (#7075)、LumiGLO®化学発光試薬および過酸化物 (#7003) が含まれています。
  11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format): (#7720)
  12. 転写膜: このプロトコールは、CST社が推奨しているニトロセルロース膜用ですが、PVDF膜でも使用できます。

(Milli-Q®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B 電気泳動および転写

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

  1. 調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 培地を吸引除去し、1×PBSで細胞を洗浄後、再度、上清を吸引除去してください。
  3. 1×SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートの場合は100 μL/well、直径10 cmのプレートの場合は500 μL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  4. 細胞を完全に溶解するため、また、DNAをせん断しサンプルの粘性を下げるために10-15秒間超音波処理してください。
  5. サンプル20 μLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷冷してください。
  6. 5分間遠心してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm×10 cm) に20 μLアプライし、電気泳動してください。
    注意: CST社は、転写確認用のPrestained molecular weight markers (#7720、10 μL/lane) および分子量測定用のBiotinylated protein ladder (#7727、10 μL/lane) も同時に電気泳動することをお薦めしています。
  8. ニトロセルロース膜もしくはPVDF膜に転写してください。

C 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意: 10 cm×10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調整してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション: 転写後、必要に応じてTBS 25 mLでニトロセルロース膜を室温で5分間洗浄してください。
  2. ブロッキングバッファー25 mL中で転写膜を室温で1時間インキュベートしてください。
  3. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。

II. 一次抗体反応

  1. 一次抗体に応じて、適切な下記手順へ進んでください。

非標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. HRP標識二次抗体 (1:2,000) およびビオチン標識タンパク質マーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体 (#7075)(1:1,000) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

HRP標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. ビオチン標識タンパク質マーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体 (#7075)(1:1,000) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

ビオチン標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. 適切な希釈率に希釈したHPR標識ストレプトアビジンを含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

ビオチン標識タンパク質マーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体は加えないでください。一次抗体検出用のHPR標識ストレプトアビジンでビオチン標識マーカーも検出できます。

D 検出

  1. LumiGLO® (20×LumiGLO® 0.5 mL、20×Peroxide 0.5 mLおよびMilli-Q®水9.0 mL) 10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。
    注意: 反応が早すぎる場合は、LumiGLO®基質を希釈してください。
  2. 転写膜の余分な液を除去し (乾燥させないでください)、ラップで包んでX線フィルムに感光してください。初回の10秒間の露出で適度な露出時間が予測できます。
    注意: 検出反応速度論に基づき、シグナルはLumiGLO®とのインキュベーション直後が最も強く、2時間かけて減退します。

posted June 2005

revised November 2008

ウェスタンブロッティング　プロトコール (Western)

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