PathScan^® Chemiluminescent ELISA プロトコール (Chemiluminescent ELISA)

home > プロトコール集 > PathScan^® Chemiluminescent ELISA プロトコール (Chemiluminescent ELISA)

 

注意: アッセイのインキュベーション温度は、製品のデータシートを参照してください。

注意: このChemiluminescent ELISAは低容量マイクロプレートを採用しています。各マイクロウェルに必要なサンプルと試薬は50 μLです。

A. 試薬

1. 使用前に全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
2. (Pathscan^® Sandwich ELISA Kitに含まれる) 20×洗浄バッファーをMilli-Q^®もしくは同等の精製水で希釈し、1×洗浄バッファーを調製してください。
3. 1×細胞溶解バッファー: (10X Cell Lysis Buffer #9803)
   このバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。
   注意: CST社は使用直前に1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) の添加を推奨しています。
   • 20 mM Tris (pH 7.5)
   • 150 mM NaCl
   • 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA)
   • 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)
   • 1% Triton X-100
   • 2.5 mM sodium pyrophosphate
   • 1 mM β-glycerophosphate
   • 1 mM Na3VO4
   • 1 μg/mL leupeptin

(Milli-Q^®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B. 細胞溶解物の調製

1. 培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
2. 非変性状態で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回すすいでください。
3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に氷冷した1 mM PMSFを添加した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
4. プレートから細胞をこすり落とし、適切なチューブに移してください。氷上に置いてください。
5. 氷上で溶解物を超音波処理してください。
6. 4℃で10分間遠心し、新しいチューブに上清を移してください。上清が細胞溶解物です。溶解物は、1回分ずつに小分けし、–80℃で保存してください。

C. 操作手順

1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要数のマイクロウェルを折り取ってください。マイクロウェルをストリップホルダーに置いてください。使用しないマイクロウェルは、再封し、すぐに4℃で保存してください。
2. 遠心用チューブに (各Pathscan^® Sandwich ELISA Kitに入っている青色の) サンプル希釈液50 μLを加えてください。チューブに細胞溶解物50 μLを移し、数秒間ボルテックスしてください (推奨細胞溶解バッファーを細胞抽出に使用した場合、ウェルにアプライしたサンプルを1:1に希釈できます)。溶解物の適切な希釈係数とキットの分析結果に関する情報は、各キットの個々のデータシートに記載されています。
3. 適切なウェルに希釈した各細胞溶解物50 μLを加え、テープで密封後、マイクロウェルの上からしっかりと押し付けてください。プレートを2時間インキュベートしてください。あるいは、プレートを4℃で一晩インキュベートすることで、標的タンパク質の最良の検出ができます。
4. テープを優しくはがし、ウェルを洗浄してください:
   1. 容器にプレート内容物を捨ててください。
   2. 各ウェルを1×洗浄バッファー150 μLで4回洗浄してください。
   3. 洗浄毎に、新しいペーパータオルにプレートを叩きつけて、各ウェルに残っている溶液を除去してください。ただし、常にウェルを完全に乾燥させないでください。
   4. キムワイプで全てのウェルの裏側を拭いてください。
5. 各ウェルに検出抗体 (緑色) 50 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを1時間インキュベートしてください。
6. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
7. 各ウェルにHRP標識二次抗体 (赤色) 50 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを30分間インキュベートしてください。
8. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
9. Luminol/Enhancer SolutionとStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合した作用液を調製してください。
10. 各ウェルに作用液100 μLを加えてください。

基質の添加後1-10分以内に425 nMで相対発光量 (RLU) をplate-based luminometerで測定してください。

10分以内に測定した場合に至適シグナル強度を得られます。