Enzyme Immuno Assay (EIA) プロトコール

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A. 溶液および試薬

1. 使用前に、全てのマイクロウェルストリップを室温に戻してください。
2. (各キットに含まれる) 20×洗浄バッファーをMilli-Q^®もしくは同等の精製水で希釈し、1×洗浄バッファーを調製してください。
3. 10×Cell Lysis Buffer #9803をMilli-Q^®もしくは同等の精製水で希釈し、1×細胞溶解バッファーを調製してください。1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) を使用直前に添加してください。調製したバッファーは、4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

(Milli-Q^®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B. 細胞溶解物の調製

注意: 下記には96ウェルプレート用の容量を記載しています。サイズの異なるプレート (6、12、24、48ウェルなど) を使用する際は、適宜容量を調整してください。

1. 細胞を96ウェルプレート (6-100×10³細胞/ウェル程度) に蒔き、適切な細胞培養条件下で一晩インキュベートしてください。
2. 細胞を加温したPBS 200 μLですすいでください。その後、試験化合物を無血清培地に加え、細胞を必要時間インキュベートしてください。
3. 細胞を氷冷したPBS 200 μLですすいでください。その後、1×細胞溶解バッファーを各ウェルに100 μL加え、細胞を氷上に5-10分間置いてください。

注意: 細胞片が認められた場合、プレートを軽く遠心して細胞片を除去し、細胞溶解物を新しい96ウェルプレートに移してください。

C. 操作手順

1. 全てのキット構成品を室温に戻してください。
2. HRP標識した標的を含む溶液50 μLとサンプル50 μLを抗体が固相化されたアッセイプレートに加えてください。テープで密封後、水平偏心式振盪機で室温、3時間インキュンベートしてください。
3. プレートの内容物を捨て、各ウェルを1×洗浄バッファー200 μLで4回洗浄してください。洗浄毎に、各ウェルに残っている溶液を全て除去してください。ただし、ウェルを完全に乾燥させないでください。
4. TMB基質100 μLを加えてください。
5. 室温で30分間インキュベートしてください。

注意: 30分経過する前に反応を停止させる必要がある場合がありますので、色の変化を注意深く観察してください。

6. STOP溶液100　μLを加えてください。
7. 450 nmの吸光度を測定してください。(最適な結果を得るため、STOP溶液添加後、30分以内に吸光度を測定してください。)

注意: 試験した物質の絶対量を測定するために、標準曲線の作成が毎回必要です。製品のデータシートにある詳細なプロトコールに従って標準曲線の濃度幅を決定してください。