蛍光ウェスタンブロッティング プロトコール (一次抗体希釈液: BSA) (Fluorescent Western BSA)

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5% w/v BSA、1×TBS、0.1% Tween-20で希釈した一次抗体と転写膜を穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートしてください。

注意: 2色の蛍光染色を発現させる場合は、由来種の異なる一次抗体と、各一次抗体に適し、異なる色素で標識された二次抗体が必要となります。 一次抗体の抗体希釈バッファーが異なる場合は、一次抗体を個別に各々のバッファーでテストし、最適条件を見つけてください。

A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q®もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 1×PBS
  2. 1×SDSサンプルバッファー: (#7722、#7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25℃)、2% w/v SDS、10%グリセロール、50 mM DTT、0.01% w/v ブロモフェノールブルー、もしくはフェノールレッド
  3. 転写バッファー: 25 mM Tris base、0.2 Mグリシン、20%メタノール (pH 8.5)
  4. 10×TBS: Tris base 24.2 g、NaCl 80 gを精製水に溶解し、1×HClでpH 7.6に調整後、全量を1 Lにしてください。
  5. 脱脂粉乳 (#9999)
  6. ブロッキングバッファー：1×TBS with 5% w/v 脱脂粉乳; 150 mL用意する場合は、10×TBS 15 mLを精製水135 mLに加えて撹拌後、脱脂粉乳7.5 gを加えてよく混ぜてください。
  7. 洗浄バッファー: (#9997) 1×TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)
  8. ウシ血清アルブミン (BSA) (#9998)
  9. 一次抗体希釈バッファー: 1×TBS、0.1% Tween-20 with 5% BSA; 20 mL用意する場合は、10×TBS 2 mLを精製水18 mLに加え、BSA 1.0 gを溶解後、スターラーで撹拌しながらTween-20 (100%) 20 μLを加えてください。
  10. 二次抗体希釈バッファー: 1×TBS、0.1% Tween-20 with 5%脱脂粉乳; 20 mL用意する場合は、10×TBS 2 mLを精製水18 mLに加え、脱脂粉乳1.0 gを溶解後、スターラーで撹拌しながらTween-20 (100%) 20 μLを加えてください。
  11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) (#7720)
  12. 転写膜: このプロトコールは、CST社が推奨しているニトロセルロース膜用に最適化しています。

(Milli-Q®は、Millipore Corporationの登録商標です。)

B 電気泳動および転写

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

  1. 調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 培地を吸引除去し、冷えた1×PBSで細胞を洗浄後、再度、上清を吸引除去してください。
  3. 1×SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートの場合は100 μL/well、直径10 cmのプレートの場合は500 μL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  4. 細胞を完全に溶解するため、また、DNAをせん断しサンプルの粘性を下げるために10-15秒間超音波処理してください。
  5. サンプル20 μLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷冷してください。
  6. 5分間遠心してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm×10 cm) に20 μLアプライし、電気泳動してください。

注意: CST社は、転写確認と分子量測定のためにPrestained molecular weight markers (#7720、10 μL/lane) を同時に電気泳動することをお薦めしています。プレステインマーカーは近赤外蛍光を発します。

  1. ニトロセルロース膜に転写してください。

C 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意: 10 cm×10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調整してください。

  1. オプション: 転写後、必要に応じてTBS 25 mLでニトロセルロース膜を室温で5分間洗浄してください。
  2. ブロッキングバッファー25 mL中で転写膜を室温で1時間インキュベートしてください。
  3. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  4. 一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  6. 蛍光標識二次抗体 (1:5,000-1:25,000 dilution of 1 mg/mL stock) を含む二次抗体希釈バッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  7. TBS/T 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。

D 検出

  1. 余分なTBS/Tを除去し、転写膜を乾燥させてください。
  2. 蛍光スキャナーにより、転写膜上のタンパク質を検出してください。

posted May 2008

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