HRP Chemiluminescence ELISA-P

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A. 試薬

  1. 炭酸バッファー: 15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2 g/L NaN3 (pH 9.6)。炭酸バッファーに合成ペプチド1 μMを加えたものを使用します。
  2. 10×PBS: 1L用意する場合、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 14.4 gおよびKH2PO4 2.4 gを精製水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
  3. 洗浄バッファー: 0.05% Tween-20を含む1×PBS (PBST)
  4. ブロッキングバッファー: 10 mg/mLウシ血清アルブミン (BSA) in PBST
  5. 一次抗体希釈バッファー: 1 mg/mL BSA in PBST
  6. 二次抗体希釈バッファー: 3% BSA in PBST
  7. 96ウェルプレート: 化学発光検出には、ソリッドホワイトまたは不透明プレートをご使用ください。

B. ペプチドの固相化

  1. 96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに1 μM合成ペプチド加炭酸バッファー100 μLを加え、4℃で一晩もしくは37℃で2-6時間インキュベートし、プレートにペプチドを固相化してください。ペプチドが結合あるいは吸着しない場合、pH 4-8の他のバッファーで試してください。
  2. 各ウェルを洗浄バッファー200 μLで3回洗浄してください。
  3. 各ウェルにブロッキングバッファー200 μLを加え、37℃で1時間ブロッキングしてください。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄してください (必要に応じて、乾燥プレートを4℃で1-2ヵ月保存することも可能です)。

C. HRP標識一次抗体

  1. 一次抗体希釈バッファーでHRP標識一次抗体を推奨希釈率で希釈し、各ウェルに100 μLを加え、37℃で1時間インキュベートしてください。
  2. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
  3. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合した作用液を調製してください。
  4. 基質を添加後1-10分以内に425 nmで相対発光量 (RLU) をplate-based luminometerで測定してください。
  5. 10分以内に測定した場合に至適シグナル強度を得られます。

D. HRP標識二次抗体

  1. 一次抗体希釈バッファーで一次抗体を推奨希釈率で希釈し、各ウェルに100 μLを加え、4℃で一晩もしくは37℃で2-6時間インキュベートしてください。
  2. 洗浄バッファーで3回洗浄してください。
  3. 二次抗体希釈バッファーでHRP標識二次抗体を推奨希釈率で希釈し、各ウェルに100 μLを加え、37℃で1時間インキュベートしてください。
  4. 洗浄バッファーで5回洗浄してください。
  5. Luminol/Enhancer Solution (#7003) とStable Peroxide Bufferを等量ずつ混合した作用液を調製してください。
  6. 基質を添加後1-10分以内に425 nmで相対発光量 (RLU) をplate-based luminometerで測定してください。
  7. 10分以内に測定した場合に至適シグナル強度を得られます。

*推奨HRP標識二次抗体:

posted October 2010

HRP Chemiluminescence ELISA-P

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