PhosphoPlus^® In-Cell Duet (ICW Compatible) プロトコール

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A 溶液および試薬

注意: 溶液は、Milli-Q^®もしくは同等の精製水で調製してください。

1. 10×PBS: 1 L用意する場合は、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 14.4 gおよびKH₂PO₄ 2.4 gを精製水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
2. ホルムアルデヒド: 新しいホルムアルデヒドを使用してください。使用時にPBSで希釈してください。
3. ブロッキングバッファー (1×PBS/5% 正常ヤギ血清/0.3% Triton X-100): 25 mL用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、正常ヤギ血清 1.25 mLおよび精製水21.25 mLを加えて混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 µLを加えてください。
4. 抗体希釈バッファー (1×PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100): 25 mLを用意する場合は、10×PBS 2.5 mLを精製水22.5 mLに加えて混ぜ合わせてください。BSA 0.25 gを加え、溶解してください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 μLを加えてください。

(Milli-Q^®はMillipore Corporationの登録商標です。)

B 試料作製

注意: マルチウェルプレートで直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

1. 溶液を吸引除去し、細胞が2-3 mm浸る程の4%ホルムアルデヒド in 1×PBSを加えてください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

2. 細胞を室温で15分間固定してください。
3. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回すすいでください。
4. 免疫染色操作に進んでください。

C 免疫染色

注意: 非特異的バックグラウンド補正のため、一次抗体カクテルを含まない、検出カクテルのみのコントロールウェルを少なくとも1ウェル準備してください。

1. ブロッキングバッファーで試料を60分間ブロッキングしてください。
2. ブロッキングしている間に、一次抗体カクテルを抗体希釈バッファーで、データシートに示されている通りに希釈してください。
3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体カクテルをアプライしてください。
4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
5. PBSで各5分間、3回すすいでください。
6. 検出カクテルを抗体希釈バッファーで、データシートに示されている通りに希釈してください。
7. 暗室、室温で1-2時間インキュベートしてください。
8. PBSで各5分間、3回すすいでください。
9. 最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。