ChIP Assay Overview

• ChIP用抗体とプライマー
• SimpleChIP™を用いたChIP-Sequencing
• ChIPアッセイとは？


• 酵素消化 vs. ソニケーション処理
• プロトコール

ChIPアッセイの概要

クロマチン免疫沈降（ChIP）法は、細胞のクロマチン中のタンパク質－DNA相互作用を調べる、強力かつ汎用性の高い手法です（1,2）。この手法は、特定のゲノム領域と関係している複数のタンパク質の同定や、また逆に、ある特定のタンパク質に関係している多くのゲノム領域の同定に使用されます（3–6）。また、ChIPアッセイは、特定のタンパク質－DNA相互作用の空間的、経時的関係を明確にするのにも使用されます。例えば、様々なタンパク質因子を遺伝子プロモーターに動員する順序の確定や遺伝子の活性化における遺伝子座全体の特定のヒストン修飾の相対量を「測定」するのに使用できます（3,4）。ヒストンタンパク質の他、転写因子および転写補因子、DNA複製因子、DNA修復タンパク質の結合の解析にも使用可能です。

ChIPアッセイでは、細胞内のタンパク質－DNA相互作用を固定、あるいは「保持」する可逆的なタンパク質－DNA架橋剤であるホルムアルデヒドで細胞をまず固定します（method overviewをご覧ください）（1,2）。次に細胞をすすぎ、ソニケーションか酵素消化によりクロマチンを回収し断片化して、特定のタンパク質あるいはヒストン修飾に特異的な抗体を用いてクロマチンを免疫沈降します。目的のタンパク質やヒストン修飾に関連するDNA配列は、クロスリンクしたクロマチン複合体の一部として共沈降し、この過程でDNA配列の相対量が増加します。免疫沈降後にタンパク質－DNAを脱クロスリンクし、DNAを精製します。このDNA配列の濃縮物をさまざまな手法で解析することができます。

スタンダードPCRは、特定のタンパク質やヒストン修飾に関わるDNA配列またはゲノム領域の同定に使用します（1,2）。PCRは、“コントロールの非特異的抗体による免疫沈降物”に対する“タンパク質特異的な免疫沈降により濃縮した特定のDNA配列”の相対的存在量の測定に使用します。PCR産物をアガロースゲルかアクリルアミドゲルで泳動して定量化し、インプットDNAの全体量と比較して（インプット率）DNA配列の増幅率を決めます。増幅率は、バックグラウンドに対する増幅倍率（コントロールの非特異的抗体に対する増幅）と表すこともできます。Real-Time PCRは、スタンダードPCRより正確でゲルを不要とする、DNA増幅を定量化する手法です。あるいは、ChIPアッセイをゲノムタイリングマイクロアレイ（ChIP on chip）法やシークエンシング、クローニング法と組み合わせ、タンパク質－ DNA相互作用やヒストン修飾をゲノムレベルで解析をすることもできます（5–8）。

SimpleChIP™ Kitには、哺乳類の細胞のChIPアッセイに必要なバッファーと試薬が含まれており、ヒストン修飾と非ヒストンDNA結合タンパク質の両方でご使用いただけます。細胞を溶解後、クロマチンをMicrococcal Nucleaseで部分消化により断片化し、1－5ヌクレオソームのクロマチン断片にします。クロマチンの酵素消化はソニケーション法よりも穏やかで、クロマチンが完全に断片化できなかったり、あるいはタンパク質の変性や分解によるエピトープの損傷を引き起こすクロマチンの乳化やソニケーションパワーのばらつきによる問題を回避することができます。クロマチン免疫沈降は、抗体とChIP Grade Protein G AgaroseかChIP Grade Protein G Magnetic Beadsのどちらかを使用して行います。タンパク質－DNAのクロスリンクを外した後、キット中のDNA精製スピンカラムでDNAを精製します。DNA精製スピンカラムは、スピンカラム技術の利便性とフェノール/クロロフォルム抽出やエタノール沈降なしでDNAを効率的に回収し、夾雑タンパク質を除去できる特製シリカ膜の選択的結合特性を組み合わせたものです。DNA精製後、スタンダードPCR、定量real-time PCR、ChIP on chipの増幅、シークエンシング、あるいはクローニング法など、様々な手法で特定のDNA配列の増幅を解析できます。

SimpleChIP™ Kitには、ChIPアッセイに必要なバッファーや試薬だけでなく、ChIP実験が成功したかどうかを確認するのに重要なコントロールも同梱しています。キットには、ポジティブコントロールのHistone H3 AntibodyとネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG Antibody、ribosomal protein L30（RPL30）の遺伝子座のPCR検出用のプライマーセット（ヒトとマウスのプライマーセット）が入っています。Histone H3は、細胞内のクロマチンの主な構成要素でRPL30遺伝子座を含むゲノムのほとんどのDNA配列に結合します。従って、Histone H3 Antibodyを使用したクロマチンの免疫沈降がRPL30遺伝子を濃縮するのに対し、Normal Rabbit IgGを使用した免疫沈降はRPL30遺伝子を濃縮しません。増幅率は、キット中のRPL30プライマーセットとスタンダードPCRや定量real-time PCRで定量化することができます。重要な点は、Histone H3がゲノムのほとんどのDNA配列に結合するために、Histone H3 Antibodyは研究されているほとんどの遺伝子座のIPのポジティブコントロールとなり、ChIP実験がうまくいったかどうかの確信を深められるということです。

SimpleChIP™ Kitには、6回のクロマチン調製（もしくは最適化）と30回の免疫沈降分の試薬が入っており、1回のクロマチン調製を4 X 10⁷ cellsで行うことを前提に最適化されています。ChIPアッセイは翌日には完了しますし、また、細胞数の増減に合わせてスケールを容易に変更することができます。

Background References

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2. Kuo MH, Allis CD (1999) In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods 19(3), 425–33.
3. Agalioti T, Lomvardas S, Parekh B, Yie J, Maniatis T, Thanos D (2000) Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell 103(4), 667–78.
4. Soutoglou E, Talianidis I (2002) Coordination of PIC assembly and chromatin remodeling during differentiation-induced gene activation. Science 295(5561), 1901–4.
5. Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE (2007) Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448(7153), 553–60.
6. Lee TI, Jenner RG, Boyer LA, Guenther MG, Levine SS, Kumar RM, Chevalier B, Johnstone SE, Cole MF, Isono K, Koseki H, Fuchikami T, Abe K, Murray HL, Zucker JP, Yuan B, Bell GW, Herbolsheimer E, Hannett NM, Sun K, Odom DT, Otte AP, Volkert TL, Bartel DP, Melton DA, Gifford DK, Jaenisch R, Young RA (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125(2), 301–13.
7. Weinmann AS, Farnham PJ (2002) Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods 26(1), 37–47.
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