ケーススタディ 2: 感度 (XP®モノクローナル抗体)
#4858 Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAbと他のラビットモノクローナル抗体との比較
#4858 Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb をCST のXP®抗体の非常に優れた感度の実証例としてご覧いただけます。
ここでは、#4858を従来の技術で製造したウサギモノクローナル抗体 (#4857と#4856) と比較しました。CST の抗体バリデーションの最重要項目は、ウェスタン分析で適切な分子量に特異的なシグナルを観察することです。Figure 1A とB に示しますように、CST の3つすべての抗体は適切な分子量に単一の特異的なバンドを検出します。これはCST の高水準の製品規格によるもので、この厳格な品質管理により高品質の製品のご提供を可能にします。
以下ではXMT®で製造した#4858の優れた感度を示します。
- XMT®で製造した#4858を段階希釈してウェスタン分析したところ、#4856よりも低濃度でターゲット特異的なシグナルを検出しました (Figure 1A)。#4858の優れた感度と親和性を示しています。
- #4856や#4857に比べて、#4858は低いライセート濃度でもシグナルを検出します (Figure 1B)。
- パラフィン包埋した結腸癌サンプルを用いた免疫組織染色 (IHC) 試験では、最適な抗体濃度において、#4858が#4857よりも高い感度を示しました (Figure 2)。
- 共焦点免疫蛍光分析では、 最適濃度の#4858でわずかに強いシグナルを検出しました (Figure 3A)。
- ハイコンテントプラットフォームを用いて、段階希釈して免疫蛍光強度を定量化したところ、#4858は#4856よりも有意に高い強度を示しました (Figure 3)。
- フローサイトメトリーを用いた比較試験では、#4858は#4856より低い濃度でも強いシグナルを検出でき、薬剤処理による変化をよりはっきり観察できました (Figure 4)。
結論として、CST の#4858 Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb は、優れたパフォーマンスが必要なイメージングをベースとした分析において、優れた感度を示しました。さらに、#4858はすべてのアプリケーションでCST 社内規格試験に合格しています。Table 1 に概要を示しましたのでご参照ください。
Figure 1A. Western blot analysis of extracts from insulin-treated HeLa cells using serial antibody dilutions of #4858 and #4856, starting at 1 μg/ml. Both antibodies generate a clean and specific signal. However, a much more intense signal was observed with #4858. On the 5 second exposure shown, #4858 generates a strong signal at 1 ng/ml, while the signal from #4856 is much weaker.
Figure 1B. Western blot analysis of a serial dilution of extracts from insulin-treated HeLa cells (100 nM for 10 min.) detected with CST selling stocks of #4858, #4856 and #4857 at 1:1000 dilution. Again, the strongest signal was observed using #4858.
Figure 2. Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded colon carcinoma using #4858 and #4857 at matched concentrations (80 ng/ml). While both antibodies generate a specific signal, dramatically greater signal strength was observed using #4858.
Figure 3A. Confocal immunofluorescent analysis of C6 cells, LY294002, U0126 and rapamycin-treated for 2 hours (upper) or insulin-treated (100 nM for 30 min., lower), using #4858 (left) or #4856 (right). Actin filaments have been labeled with Alexa Fluor® 555 phalloidin (red). Blue pseudocolor = DRAQ5® (fluorescent DNA dye). At optimal concentration (0.25 μg/ml) #4858 appears to generate a stronger signal. For numerical values see panel Figure 3B.
Figure 3B. Side by side immunofluorescent titration analysis comparing #4858 with #4856. Optimal concentration for both antibodies was determined to be 0.25 μg/ml for both antibodies. At this concentration signal brightness was 2 fold higher in #4858 than #4856, demonstrating greater sensitivity.
Figure 4A. Flow cytometric titration analysis of Jurkat cells, LY294002, wortmannin and U0126-treated, comparing #4858 and #4856. Optimal concentration was determined as 0.25 and 0.5 μg/ml, for #4858 and #4856, respectively. At these concentrations signal brightness was almost 2 fold higher using #4858 than #4856. Moreover, fold induction over control was also nearly 2 fold higher (not shown). Taken together, these results indicate greater sensitivity by flow cytometry.
Figure 4B. Flow cytometric analysis of Jurkat cells, untreated (grey fill) or treated with LY294002, wortmannin and U0126 (no fill), comparing #4858 and #4856 at optimal concentration (0.25 and 0.5 μg/ml).
| No. | Antibody | Reactivity | WB | IHC | Flow | IF |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 4858 | Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb | H, M, R, Mk, Sc, (C) | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
| 4856 | Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (2F9) Rabbit mAb | H, M, R | ++ | - | ++ | ++ |
| 4857 | Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (91B2) Rabbit mAb | H, M, R | ++ | +++ | N/T | ++ |
Table 1. Summary of Phospho-S6 antibodies compared in the study.
Applications Key: WB=Western Blotting IHC=Immunohistochemistry Flow=Flow Cytometry IF=Immunofluorescence
Testing Data Key: (++++)=Very Highly Recommended (+++)=Highly Recommended (++)=Recommended (-)=Not Recommended N/T=Not Tested
Reactivity Key: H=Human M=Mouse R=Rat Mk=Monkey C=Chicken Sc=S.cerevisiae
Species enclosed in parentheses are predicted to react based on 100% sequence homology.