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Akt Signaling

最初にがん原遺伝子として発見されて以来、セリン/スレオニンキナーゼのAkt (プロテインキナーゼBまたはPKBとしても知られる) は、がんの進行やインスリンの代謝などの様々な細胞過程において重要な調節的役割を担うことから注目を浴びてきました。Aktには3つの関連性の高いアイソフォーム (Akt1、Akt2、Akt3) があり、これらがPI3Kの主要なシグナル伝達経路となります。

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#4060 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbと他社製品との抗体比較

ウェスタンブロッティング

サンプル: Aktのリン酸化レベルを保持するために強力なホスファターゼ阻害剤である#9902 Calyculin Aで、またはPI3キナーゼを介したAktのリン酸化を阻害するためにPI3キナーゼ特異的阻害剤である#9901 LY294002で処理したJurkat細胞を使用しました。

Western Blot Comparison
  • CSTの#4060 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbは、Calyculin Aで処理したJurkat細胞抽出物に対し、60 kDaの特異的な強いバンドを検出します。
  • Company 1のPhospho-Akt (Ser473) rabbit polyclonal antibodyは適切なバンドを検出しますが、75 kDa付近に別のバンドも検出します。これより、この抗体がリン酸化Akt特異的でないことがわかります。
  • Company 2のPhospho-Akt (Ser473) rabbit polyclonal antibodyは、適切なバンドに加えて多数の非特異バンドを検出し、標的タンパク質のバンドが他のバックグラウンドよりも弱いことがわかります。
CST #4060 Company 1 Company 2
Product 4060
Dilution 1:2000 1:200* 1:2500*
Conc. (μg/mL) 0.043 0.5 0.2

*メーカー推奨の希釈率

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免疫組織染色

サンプル: Aktのリン酸化を阻害するPI3キナーゼ特異的阻害剤である#9901 LY294002で未処理または処理したLNCaP前立腺がん細胞ペレット (図A) と、ヒト乳がん組織 (図B) を使用しました。

CSTの#4060 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAbとCompany 1のphospho-Akt antibodyの最適希釈率は、細胞ペレットでまず決定しました (図A)。ヒト乳がん組織での抗体比較には、この希釈率を用いました (図B)。#4060の標的特異的な染色は、Company 1の抗体の染色よりもはるかに強く、はっきりしています。細胞ペレットを用いた実験では2つの抗体の染色は全く同等に見えますが、組織の染色にはより優れた抗体感度が必要であり、#4060は織染切片の染色に優れた抗体といえます。

図をクリックし、拡大してご覧ください

IHC Figure A
IHC Figure B

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免疫蛍光染色

サンプル: Aktのリン酸化を阻害するPI3キナーゼ特異的阻害剤である#9901 LY294002で、またはAktのリン酸化を誘導するインスリンで処理したC2C12マウスの筋前駆細胞を使用しました。

IF Figure A

図A

用いた抗体濃度:

  • CST#4060: 0.375 μg/mL
  • Company 1: 0.5 and 2 μg/mL

結果:

  • #4060 (緑) は、適切にインスリン刺激後の細胞膜を染色し、LY294002処理細胞に染色がほとんどありません。
  • Company 1の抗体は、2 μg/mLの場合インスリン処理細胞において#4060に匹敵するシグナル強度ながら細胞質が染色され、LY294002処理細胞でもわずかな細胞質染色を示しました。0.5 μg/mLでは、Company 1の抗体は#4060に比べてインスリン処理細胞で低いシグナルを示しました。

このデータより、#4060が少ない抗体量で強いシグナルを示すことがわかります。

IF Figure B

図B

用いた抗体濃度:

  • CST#4060: 0.375 μg/ml
  • Company 2: 0.625 and 1.25 μg/mL

結果:

  • #4060 (緑) は、適切にインスリン刺激後の細胞膜を染色し、LY294002処理細胞に染色がほとんどありません。
  • Company 2の抗体は、1.25 μg/mLでLY294002処理細胞とインスリン処理細胞の両方に特に核が強く染まった高いバックグラウンド染色を示しました。0.625 μg/mLでは、インスリン処理細胞でシグナルがかろうじて検出できました。

このデータより、#4060が少ない抗体量で強いシグナルを示すことがわかります。

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