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免疫蛍光染色 プロトコール (IF)

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最良の結果を得るために、各製品の推奨プロトコールを使用することを強くお薦めいたします。

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*重要: 製品が培養細胞株 (IF-IC)、パラフィン包埋サンプル (IF-P) あるいは凍結細胞切片 (IF-F) で検証され、使用が推奨されているかどうかを、データシート第一面のAPPLICATIONSあるいはwebの製品ページで確認してください。適切な抗体希釈率と抗原賦活化の手順は、各製品のデータシートもしくはwebの製品ページを参照してください。このプロトコールは、非標識および蛍光標識抗体で共にご使用いただけます。

注意: いくつかのCST抗体は、最良の結果を得るために専用のプロトコールを用います。製品専用の推奨プロトコールは、各製品のデータシートをご確認ください。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えて混ぜ合わせてください。

    注意: pH 8.0に調整してください。

  2. 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存してください。4%ホルムアルデヒドは1×PBSで4倍に希釈してください。
  3. ブロッキングバッファー: (1×PBS/5%正常ヤギ血清/0.3% Triton™ X-100): 10 mL用意する場合は、二次抗体と同種の正常血清 (例: 正常ヤギ血清) 0.5 mLを1×PBS 9.5 mLに加えてよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton™ X-100 30 μLを加えてください。
  4. 抗体希釈バッファー: (1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100): 10 mL用意する場合は、Triton™ X-100 30 μLを1×PBS 10 mLに加えてよく混ぜ合わせてから、BSA 0.1 gを加えてよく混ぜ合わせてください。
  5. 蛍光標識二次抗体: (Anti-mouse #4408#4409#8890#4410) (Anti-rabbit #4412#4413#8889#4414) (Anti-rat #4416#4417#4418)
  6. ProLong® Gold Antifade Reagent (#9071) あるいはDAPI入り (#8961)

IF-P用試薬:

  1. キシレン
  2. エタノール (無水変性、病理学グレード、100%および95%)
  3. 抗原賦活化液:
    1. クエン酸: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー: 1 L用意する場合は、C6H5Na3O7•2H2O 2.94 gを精製水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
    2. EDTA: 1 mM EDTA: 1 L用意する場合は、EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 0.372 gを精製水に溶解し、pH 8.0に調整後、全量を1 Lにしてください。

B. 試料作製

I. 培養細胞株 (IF-IC)

注意: マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

  1. 溶液を吸引除去し、細胞が2-3 mm浸る程の温めた1×PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドを加えてください。

    注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  2. 細胞を室温で15分間固定してください。
  3. 固定液を吸引除去し、1×PBSで各5分間、3回すすいでください。
  4. 免疫染色操作Cに進んでください。

II. パラフィン切片 (IF-P)

注意: 操作の間、常にスライドを乾かさないでください。

  1. 脱パラフィン/再水和:
    1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
    2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
    4. 精製水で切片を各5分間、2回すすいでください。
  2. 抗原賦活化:

    注意: 抗原賦活化液は製品により推奨が異なりますので、製品のデータシートあるいはwebの製品ページを参照してください。

    1. クエン酸の場合: 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を10分間維持してください。実験台上でスライドを30分間冷却してください。
    2. EDTAの場合: 1 mM EDTA (pH 8.0) 中でスライドを沸騰させた後、沸騰直前の温度を15分間維持してください。冷却は必要ありません。
  3. 免疫染色操作Cに進んでください。

III. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

  1. 固定済み凍結組織切片の場合、免疫染色操作Cに進んでください。
  2. 作製したての凍結/未固定組織切片の場合、下記手順ですぐに固定してください。
    1. 温めた1×PBSで希釈した4%ホルムアルデヒドで切片を覆ってください。
    2. 切片を室温で15分間固定してください。
    3. PBSでスライドを各5分間、3回すすいでください。
    4. 免疫染色操作Cに進んでください。

C. 免疫染色

注意: 乾燥と蛍光色素退色の防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

  1. ブロッキングバッファーで試料を60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、一次抗体を抗体希釈バッファーで、データシートに示されている通りに希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体をアプライしてください。
  4. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  5. 1×PBSで各5分間、3回すすいでください。

    注意: 蛍光標識一次抗体を使用する場合は、ステップC8.に進んでください。

  6. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体と、暗室、室温で1-2時間インキュベートしてください。
  7. ステップC5.と同様に、1×PBSですすいでください。
  8. スライドにProLong® Gold Antifade Reagent (#9071) あるいはDAPI入り (#8961) を添加し、カバースリップで覆ってください。
  9. 最良の結果を得るために、封入剤を室温で一晩硬化させてください。スライドを長期保存する際は、4℃、暗所で、フラットに保存してください。

推奨二次抗体:

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

Anti-Rat

posted November 2006 • revised November 2013

免疫蛍光染色 プロトコール (IF)