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PathScan® Sandwich ELISA プロトコール (Colorimetric) (Sandwich ELISA)

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最良の結果を得るために、各製品の推奨プロトコールを使用することを強くお薦めいたします。

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注意: アッセイのインキュベーション温度は、製品のデータシートあるいはwebの製品ページを参照してください。

A. 試薬の調製

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  2. マイクロウェルストリップ: 使用前に全てを室温に戻してください。
  3. 1×洗浄バッファー: (PathScan® Sandwich ELISAキットに含まれる) 20×洗浄バッファーを精製水で希釈し、1×洗浄バッファーを調製してください。
  4. 1×細胞溶解バッファー: (10×Cell Lysis Buffer #9803) 1×細胞溶解バッファーを10 mL用意する場合は、10×細胞溶解バッファー1 mLを精製水9 mLに加え、混ぜ合わせてください。
    (1×PathScan® Sandwich ELISA Lysis Buffer #7018) このバッファーはすぐにご使用可能です。
    両バッファーとも4℃で短期間 (1-2週間) 保存できます。

    推奨: 使用直前に1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF #8553) を添加してください。
    注意: PMSF (#8553) は本キットに含まれません。
    注意: 推奨溶解バッファーは、製品のデータシートあるいはwebの製品ページを参照してください。

  5. TMB基質 (#7004)
  6. STOP溶液 (#7002)

B. 細胞溶解物の調製

接着細胞の場合

  1. 培養が80-90%コンフルエンスに達したら培地を吸引除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 培地を除去し、氷冷した1×PBSで細胞を1回すすいでください。
  3. PBSを除去し、各プレート (直径10 cm) に1 mM PMSF含有の氷冷した1×細胞溶解バッファー0.5 mLを加え、プレートを氷上で5分間インキュベートしてください。
  4. プレートから細胞をこすり落とし、適切なチューブに移してください。氷上に置いてください。
  5. 氷上で溶解物を超音波処理してください。
  6. 4℃で10分間遠心 (×14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞溶解物です。溶解物は1回分ずつに小分けし、-80℃で保存してください。

浮遊細胞の場合

  1. 生細胞数が0.5-1.0×106個/mLに達したら低速遠心分離 (-1,200 rpm) で培地を除去し、調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 細胞を低速遠心分離 (-1,200 rpm) で集め、氷冷した1×PBS 5-10 mLで細胞を1回洗浄してください。
  3. 増殖培地50 mLから採取した細胞を1 mM PMSF含有1×細胞溶解バッファー2.0 mLで溶解してください。
  4. 氷上で溶解物を超音波処理してください。
  5. 4℃で10分間遠心 (×14,000 rpm) し、上清を新しいチューブに移してください。上清が細胞溶解物です。溶解物は1回分ずつに小分けし、-80℃で保存してください。

C. 操作手順

  1. マイクロウェルストリップが室温に戻った後、必要数のマイクロウェルを折り取り、ストリップホルダーに設置してください。使用しないマイクロウェルは、再封し、すぐに4℃で保存してください。
  2. 細胞溶解物は、そのまま、もしくは (各Pathscan® Sandwich ELISAキットに含まれる青色の) サンプル希釈液で希釈して使用します。溶解物の適切な希釈係数とキットの分析結果に関する情報を、各キットの個々のデータシートあるいはwebの製品ページに記載しています。
  3. 適切なウェルに未希釈、あるいは希釈した各細胞溶解物100 μLを加え、テープで密封後、マイクロウェルの上からしっかりと押し付けてください。プレートを37℃で2時間インキュベートしてください。あるいは、プレートを4℃で一晩インキュベートしてください。
  4. テープを優しくはがし、ウェルを洗浄してください:
    1. 容器にプレート内容物を捨ててください。
    2. 各ウェルを1×洗浄バッファー200 μLで4回洗浄してください。
    3. 洗浄毎に、新しいペーパータオルにプレートを叩きつけ、各ウェルに残っている溶液を除去してください。ただし、常にウェルを完全に乾かさないでください。
    4. キムワイプで全てのウェルの裏側を拭いてください。
  5. 各ウェルに検出抗体 (緑色) 100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で1時間インキュベートしてください。
  6. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
  7. 各ウェルにHRP標識二次抗体 (赤色) 100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で30分間インキュベートしてください。
  8. ステップC4.と同様に、洗浄操作を繰り返してください。
  9. 各ウェルにTMB基質100 μLを加えてください。テープで密封し、プレートを37℃で10分間、あるいは25℃で30分間インキュベートしてください。
  10. 各ウェルにSTOP溶液100 μLを加えてください。数秒間緩やかにゆすってください。

    注意: 陽性反応の最初の色は青色です。STOP溶液を加えることにより黄色に変わります。

  11. 結果を測定してください。
    1. 色別判定: STOP溶液添加後、30分間以内に結果を判定してください。
    2. 吸光度測定: キムワイプでウェルの裏側を拭き、STOP溶液添加後、30分間以内に450 nmの吸光度を測定してください。

posted June 2005 • revised November 2013

PathScan® Sandwich ELISA プロトコール (Colorimetric) (Sandwich ELISA)