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ウェスタンブロッティング プロトコール (Western Blotting)

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最良の結果を得るために、各製品の推奨プロトコールを使用することを強くお薦めいたします。

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最良の結果を得るために、5% w/v 脱脂粉乳あるいはBSA、1×TBS、0.1% Tween® 20で希釈した一次抗体と転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。

注意: 推奨する一次抗体希釈バッファーは製品により異なります。一次抗体希釈バッファーと希釈率は、各製品のデータシートあるいはwebの製品ページを参照してください。

A. 溶液および試薬

注意: 溶液は、RODI (逆浸透膜濾過脱イオン) 水もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 20×PBS: (#9808) 1×PBSを1 L用意する場合は、20×PBS 50 mLを精製水950 mLに加えて混ぜ合わせてください。
  2. 10×TBS: (#12498) 1×TBSを1 L用意する場合は、10×TBS 100 mLを精製水900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  3. 1×SDSサンプルバッファー: Blue Loading Pack (#7722) もしくはRed Loading Pack (#7723) 3×SDS泳動バッファーに1/10容量の30×DTTを加え、新しい3×還元用泳動バッファーを用意してください。精製水で1×に希釈してください。
  4. 10×トリス-グリシンSDS泳動バッファー: (#4050) 1×泳動バッファーを1 L用意する場合は、10×泳動バッファー100 mLを精製水900 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  5. 10×トリス-グリシン転写バッファー: (#12539) 1×転写バッファーを1 L用意する場合は、10×転写バッファー100 mLをメタノール200 mLと精製水700 mLに加え、混ぜ合わせてください。
  6. 10×TBST: (#9997) 1×TBSTを1 L用意する場合は、10×TBST 100 mLを精製水900 mLに加えてください。
  7. 脱脂粉乳: (#9999)
  8. ブロッキングバッファー: 5% w/v 脱脂粉乳含有1×TBST; 150 mL用意する場合は、脱脂粉乳7.5 gを1×TBST 150 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  9. 洗浄バッファー: 1×TBST
  10. ウシ血清アルブミン (BSA)
  11. 一次抗体希釈バッファー: 5%脱脂粉乳あるいは5% BSA含有1×TBST (脱脂粉乳とBSAのどちらを推奨するかは各製品のデータシートで確認してください); 20 mL用意する場合は、脱脂粉乳あるいはBSA 1.0 gを1×TBST 20 mLに加え、よく混ぜ合わせてください。
  12. ビオチン標識プロテインラダー (#7727)
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa): (#13953)
  14. 転写膜: (#12369) このプロトコールは、CSTが推奨しているニトロセルロース膜用ですが、PVDF膜でも使用できます。ポアサイズは、0.2 μmをお薦めしています。
  15. HRP標識二次抗体 (anti-rabbit #7074) (anti-mouse #7076) (anti-rat #7077)
  16. 検出試薬: LumiGLO® chemiluminescent reagent and peroxide #7003あるいはSignalFire™ ECL Reagent #6883

B. 電気泳動および転写

一般的なサンプル調製は、下記プロトコールを参照してください。

  1. 調節因子を含む新しい培地で細胞を必要時間処理してください。
  2. 培地を吸引除去し、1×PBSで細胞を洗浄後、再度、上清を吸引除去してください。
  3. 1×SDSサンプルバッファーを加え (6ウェルプレートの場合は100 μL/ウェル、直径10 cmのプレートの場合は500 μL/プレート)、細胞を溶解してください。直ちにプレートから細胞をこすり落とし、遠心用チューブに移して氷上に置いてください。
  4. 細胞を完全に溶解するため、また、DNAをせん断しサンプルの粘性を下げるために、10-15秒間超音波処理してください。
  5. サンプル20 μLを95-100℃で5分間加熱処理後、氷冷してください。
  6. 5分間遠心してください。
  7. SDS-PAGEゲル (10 cm×10 cm) に20 μLアプライし、電気泳動してください。
    注意: CSTは、転写確認用のPrestained molecular weight markers (#13953、10 μL/lane) および分子量測定用のBiotinylated protein ladder (#7727、10 μL/lane) も同時に電気泳動することをお薦めしています。
  8. ニトロセルロース膜 (#12369) に転写してください。

C. 転写膜のブロッキングと抗体反応

注意: 10 cm×10 cm (100 cm2) の転写膜用の容量を記載しています。サイズの異なる転写膜をご使用の際は、適宜容量を調整してください。

I. 転写膜のブロッキング

  1. オプション: 転写後、必要に応じてTBS 25 mLでニトロセルロース膜を室温で5分間洗浄してください。
  2. ブロッキングバッファー25 mL中で転写膜を室温で1時間インキュベートしてください。
  3. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。

II. 一次抗体反応

一次抗体に応じて、適切な下記手順へ進んでください。

非標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. 適した種のHRP標識二次抗体 (#7074#7076#7077) (1:2,000) およびビオチン標識プロテインマーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体 (#7075) (1:1,000-1:3,000) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

HRP標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. ビオチン標識プロテインマーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体 (#7075) (1:1,000-1:3,000) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

ビオチン標識一次抗体の場合

  1. 製品のデータシートで推奨する一次抗体希釈バッファーで適切な希釈率に希釈した一次抗体10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  3. 適切な希釈率に希釈したHRP標識ストレプトアビジン (#3999) を含むブロッキングバッファー10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートしてください。
  4. TBST 15 mLで各5分間、3回洗浄してください。
  5. 検出操作Dに進んでください。

ビオチン標識プロテインマーカー検出用HRP標識anti-biotin抗体は加えないでください。必要ありません。HRP標識ストレプトアビジンでビオチン標識マーカーも検出できます。

D. 検出

  1. LumiGLO® (#7003; 20×LumiGLO® 0.5 mL、20×Peroxide 0.5 mLおよび精製水9.0 mL) 10 mLあるいはSignalFire™ (#6883) (Reagent A 5 mL、Reagent B 5 mL) 10 mL中で転写膜を緩やかに振盪しながら、室温で1分間インキュベートしてください。
  2. 転写膜の余分な液を除去し (乾燥させないでください)、ラップで包んでX線フィルムに感光してください。初回の10秒間の露出で適度な露出時間が予測できます。
    注意: 検出反応速度論に基づき、シグナルはインキュベーション直後が最も強く、2時間かけて減退します。

posted June 2005 • revised November 2013

ウェスタンブロッティング プロトコール (Western Blotting)