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品質管理 – ヒストン修飾抗体

ヒストン修飾を標的とした抗体の中には、類似しているものの異なるヒストン修飾に非特異的に結合してしまう抗体もあります。一方で、特異的な結合が、隣接する残基の修飾から受ける立体障害によって阻害されることもあります。ELISAやウェスタンブロッティング、ChIP、IFなどでの検証は、抗体の特異性や感度の実証に広く用いられますが、それらの手法では、近接するエピトープが抗体にどれほどの影響を与えるかを、明確に予測することはできません。したがって、ヒストン修飾を標的とする抗体を検証する際に、一般的な手法だけでは可能な検証の範囲が限られてしまいます。

これらの理由から、CSTは、修飾特異的ヒストン抗体を、Fuchs, S.M.らが発表したペプチドアレイアッセイ (1) と同様のアッセイを用いて検証しています。このアレイでは、1回の実験で、すべてのヒストンタンパク質の既知の修飾に対する交差反応性を評価することができるだけでなく、一つの修飾部位を検出する特異性が、隣接した修飾からどれほど影響を受けるのかも検証することができます。つまり、CSTは、ペプチドアレイアッセイを用いた検証により、修飾特異的ヒストン抗体が期待通りに機能することを確認しています。

  1. Fuchs, S.M., et al. (2011) Curr. Biol., 21, 53–58.
Histone Antibody Concentration

アレイ

モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、またはアセチル化されたリジン、あるいは非修飾のリジンを含むペプチドを、単独または既知の隣接したヒストン修飾 (Histone H3K4Me3やH3T3Phosなど) と組み合わせて、右図に示すようにニトロセルロース膜上にスポットしました。

抗体

ヒストン修飾抗体を、右図に示すように三つの異なる濃度にてアレイで検証します。これにより、アッセイが飽和状態に達していないことの確認と同時に、抗体の反応性を解析することができます。

解析

アレイを洗浄後、蛍光標識二次抗体とインキュベートし、その後LI-COR® Odyssey®赤外イメージングシステムを使用して測定します。

以下をクリックして、ヒストン修飾抗体の特異性検証データの例をご確認ください。

#5326 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) (D1A9) XP® Rabbit mAb

Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) (D1A9) XP® Rabbit mAb #5326.

#9725 Di-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C64G9) Rabbit mAb

#9751 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb

#9649 Acetyl-Histone H3 (Lys9) (C5B11) Rabbit mAb

#4658 Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) (D85B4) XP® Rabbit mAb

#13969 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys9) (D4W1U) Rabbit mAb

#9728 Di-Methyl-Histone H3 (Lys27) (D18C8) XP® Rabbit mAb

#9733 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb

Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733.

#14111 Mono-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D9J1D) Rabbit mAb

#2901 Di-Methyl Histone H3 (Lys36)(C75H12) Rabbit mAb

Di-Methyl Histone H3 (Lys36)(C75H12) Rabbit mAb #2901.

#4909 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) XP® Rabbit mAb

Tri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) XP® Rabbit mAb #4909.

#9083 Acetyl-Histone H2B (Lys15) (D8H1) XP® Rabbit mAb

#13534 Acetyl-Histone H4 (Lys16) (E2B8W) Rabbit mAb

Acetyl-Histone H4 (Lys16) (E2B8W) Rabbit mAb #13534.

品質管理 – ヒストン修飾抗体