CST logo

ChIP Assay Overview

 前のページに戻る クロマチン免疫沈降 (ChIP)

Method Overview

ChIP Assay Overview

Cells are fixed with formaldehyde to cross-link histone and non-histone proteins to DNA.

Chromatin is digested with Micrococcal Nuclease into 150–900 bp DNA/protein fragments.

Antibodies specific to histone of non-histone proteins are added and the complex co-precipitates and is captured by Protein G Agarose or Protein G magnetic beads.

Cross-links are reversed, and DNA is purified and ready for analysis.

ChIPアッセイの概要

クロマチン免疫沈降 (ChIP) 法は、細胞のクロマチン中のタンパク質-DNA相互作用を調べる、強力かつ汎用性の高い手法です (1,2)。この手法は、特定のゲノム領域と結合している複数のタンパク質の同定や、また逆に、ある特定のタンパク質に結合している多くのゲノム領域の同定に使用されています (3–6)。また、ChIPアッセイは、特定のタンパク質-DNA相互作用の空間的、経時的関係を明確にすることにも使用されています。例えば、様々なタンパク質因子が遺伝子プロモーターに動員される順序の確定や、遺伝子の活性化における遺伝子座全体の特定のヒストン修飾の相対量の「測定」に使用できます (3,4)。ヒストンタンパク質の他、転写因子および転写コファクター、DNA複製因子、DNA修復タンパク質の結合の解析にも使用可能です。

ChIPアッセイでは、細胞内のタンパク質-DNA相互作用を固定、あるいは「保持」する可逆的なタンパク質-DNA架橋剤であるホルムアルデヒドで細胞をまず固定します (Method Overviewをご覧ください) (1,2)。次に、細胞を溶解し、回収したクロマチンをソニケーションか酵素消化により断片化して、特定のタンパク質あるいはヒストン修飾に特異的な抗体を用いて免疫沈降します。目的のタンパク質やヒストン修飾に関連するDNA配列は、クロスリンクしたクロマチン複合体の一部として共沈降し、この過程でDNA配列の相対量が増加します。免疫沈降後にタンパク質-DNAを脱クロスリンクし、DNAを精製します。このDNA配列の濃縮物をさまざまな手法で解析することができます。

スタンダードPCRは、特定のタンパク質やヒストン修飾に関わるDNA配列またはゲノム領域の同定に使用します (1,2)。PCRは、“コントロールのNormal IgGによる免疫沈降物”に対する“あるタンパク質に特異的な免疫沈降により濃縮した特定のDNA配列”の相対的存在量の測定に使用します。PCR産物をアガロースゲルかアクリルアミドゲルで泳動して定量化し、インプットDNAの全体量と比較して (インプット率) DNA配列の増幅率を決めます。増幅率は、バックグラウンドに対する増幅倍率 (コントロールのNormal IgGに対する増幅) と表すこともできます。Real-Time PCR (qPCR) は、スタンダードPCRより正確でゲルが不要な、DNA増幅を定量化する手法です。あるいは、ChIPアッセイを次世代シーケンシングゲノムタイリングマイクロアレイ (ChIP on chip) 法やクローニング法と組み合わせ、タンパク質-DNA相互作用やヒストン修飾をゲノムレベルで解析をすることもできます (5–8)。

SimpleChIP® Kitには、哺乳類の細胞のChIPアッセイに必要なバッファーと試薬が含まれており、ヒストン修飾と非ヒストンDNA結合タンパク質の両方に使用いただけます。細胞を溶解後、クロマチンをソニケーションまたはMicrococcal Nucleaseによる部分消化で断片化し、1-5ヌクレオソームのクロマチン断片にします。クロマチン免疫沈降は、抗体とChIP Grade Protein G AgaroseかChIP Grade Protein G Magnetic Beadsのどちらかを使用して行います。タンパク質-DNAのクロスリンクを外した後、キット中のDNA精製スピンカラムでDNAを精製します。DNA精製スピンカラムは、スピンカラム技術の利便性と、フェノール/クロロフォルム抽出やエタノール沈降なしでDNAを効率的に回収して夾雑タンパク質を除去できる特製シリカ膜の選択的結合特性を組み合わせたものです。DNA精製後、スタンダードPCR、gPCR、ChIP on chipの増幅、シークエンシング、あるいはクローニング法など、様々な手法で特定のDNA配列の増幅を解析できます。

SimpleChIP® Kitには、ChIPアッセイに必要なバッファーや試薬だけでなく、ChIP実験が成功したかどうかを確認するのに重要なコントロールも同梱されています。キットには、ポジティブコントロールのHistone H3抗体とネガティブコントロールのNormal Rabbit IgG、ribosomal protein L30 (RPL30) の遺伝子座のPCR検出用のプライマーセット (ヒトとマウスのプライマーセット) が含まれています。Histone H3は細胞内のクロマチンの主な構成要素であり、RPL30遺伝子座を含むゲノムのほとんどのDNA配列に結合します。したがって、Histone H3抗体を使用したクロマチンの免疫沈降がRPL30遺伝子を濃縮するのに対し、Normal Rabbit IgGを使用した免疫沈降はRPL30遺伝子を濃縮しません。増幅率は、キット中のRPL30プライマーセットとスタンダードPCRやgPCRで定量化することができます。重要な点は、Histone H3がゲノムのほとんどのDNA配列に結合するために、Histone H3抗体は研究されているほとんどの遺伝子座のIPのポジティブコントロールとなり、ChIP実験がうまくいったかどうかの確信を深められるということです。

参考文献

  1. Orlando V (2000) Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25(3), 99–104.
  2. Kuo MH, Allis CD (1999) In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods 19(3), 425–33.
  3. Agalioti T, Lomvardas S, Parekh B, Yie J, Maniatis T, Thanos D (2000) Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell 103(4), 667–78.
  4. Soutoglou E, Talianidis I (2002) Coordination of PIC assembly and chromatin remodeling during differentiation-induced gene activation. Science 295(5561), 1901–4.
  5. Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE (2007) Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448(7153), 553–60.
  6. Lee TI, Jenner RG, Boyer LA, Guenther MG, Levine SS, Kumar RM, Chevalier B, Johnstone SE, Cole MF, Isono K, Koseki H, Fuchikami T, Abe K, Murray HL, Zucker JP, Yuan B, Bell GW, Herbolsheimer E, Hannett NM, Sun K, Odom DT, Otte AP, Volkert TL, Bartel DP, Melton DA, Gifford DK, Jaenisch R, Young RA (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125(2), 301–13.
  7. Weinmann AS, Farnham PJ (2002) Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods 26(1), 37–47.
  8. Wells J, Farnham PJ (2002) Characterizing transcription factor binding sites using formaldehyde crosslinking and immunoprecipitation. Methods 26(1), 48–56.

ChIP Assay Overview

アプリケーション

製品カタログ

お薦めリンク

Pathways & Diagrams for Epigenetic Regulation
SignalSilence siRNA