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SimpleChIP® Kit used with ChIP-Sequencing

SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) をChIP-Sequencing に活用する利点:

  • 酵素処理はソニケーションより穏やかにクロマチンを断片化しますので、クロマチンとエピトープを傷つけず、免疫沈降の効率を向上させます。
  • 免疫沈降効率の向上により、DNAに結合したタンパク質の検出能が高くなります。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beadsにはsalmon sperm DNAのようなDNAブロッキング試薬を添加しておりませんので、シークエンシングにおけるコンタミネーションの心配はございません。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beadsは遠心分離する必要がなく、より簡便なサンプル処理と完全な洗浄が可能です。
  • ChIP-Grade Protein G Magnetic beadsは、転写因子や補因子と結合したDNAを検出するのに不可欠な、低いバックグラウンドと高い検出能を実現します。

SimpleChIP® Kit used with ChIP-Sequencing

エピジェネティックランドスケープは、ユークロマチンとヘテロクロマチンの特定ドメインで構成されます。これは、細胞タイプや成長段階で異なる特有のドメインです。遺伝子発現のエピジェネティック制御は、ヒストンの翻訳後修飾を介して行われます。例えば、ヒストンH3タンパク質のLys4のトリメチル化は、活性クロマチン(ユークロマチン)に関連した修飾であり、ヒストンH3タンパク質のLys27のトリメチル化は、不活性ヘテロクロマチンの証しです。

ヒストン修飾部位の局在や転写因子の結合部位を特定するのに大変有効な方法は、クロマチン免疫沈降(ChIP)です。ChIPアッセイでは、生細胞のタンパク質とDNA基質をクロスリンクさせるのにホルムアルデヒドを使用し、このタンパク質-DNA複合体をヒストンの修飾や転写因子に特異的な抗体を用いて免疫沈降します。免疫沈降後DNAを精製し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ(ChIP-chip)でのハイブリダイゼーションや、ハイスループットDNAシークエンシング(ChIP-seq)により分析します。これらの方法は、培養細胞、細胞周期や細胞成長の特定の段階で採取した細胞、あるいは組織サンプルから直接採取した細胞を使って、細胞タイプにおけるDNA-タンパク質相互作用のスナップショットを得るのに有効です。ChIP-chipは、全ゲノムの結合部位解析に用いられた最初の手法です。しかし、ヒトゲノム全体を網羅するには複数のDNAマイクロアレイが必要で、かなりの費用が掛かります。ChIP-seq技術は、1回のシークエンスシングでゲノム全体の結合部位の特定が可能です。これはIllumina GA2 sequencerで実施可能で、増幅されたDNAフラグメントを基に正確に解読することができます。

CSTの#9003 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) を用いてChIP-seqを行い、赤白血病細胞K562でのトリメチル化ヒストンH3 Lys4とLys27のエピジェネティックなサインを特定する実験を試みました。クロマチンは、SimpleChIP®プロトコールにある方法でK562細胞から調製し、#9751 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb#9733 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb、およびネガティブコントロールとして#2729 Normal Rabbit IgGを用いて免疫沈降しました。その結果、トリメチル化ヒストンH3 Lys4とLys27の既知の結合部位における増幅がスタンダードPCRで確認できました(Figure 1)。免疫沈降したDNAは、Illumina GA2 sequencerでのシークエンシング用のライブラリーを準備するのに使用しました。得られた配列はUCSC Human Genome Assembly(HG18)で解析し、初めてマッピングされた配列のみを保持しました。増幅された結合部位は、配列検出数の増加に反映されピークが上昇します(Figure 2)。17配列の読み取りのピークの高さの平均と非常に低いバックグランドから解る通り、これらのラビットモノクローナル抗体を用いればすばらしい増幅が得られることが確認できました。

K562 chromatin was immunoprecipitated with Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751

Figure 1. K562 chromatin was immunoprecipitated with Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (lane 1), Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 (lane 2) or Normal Rabbit IgG #2729 (lane 3), using the SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003. Purified DNA was analyzed by standard PCR methods using primers specific for the transcriptionally active DHFR gene and HIST1H2AC gene cluster, or the inactive MYT1 gene.

Enrichment of tri-methyl histone H3 Lys4.

Figure 2. K562 chromatin was immunoprecipitated with Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751. The enriched DNA was sequenced using the Illumina GA2 Sequencer. The obtained sequences were mapped to the UCSC Human Genome Assembly (HG18) and data was visualized using IGB (Integrated Genome Browser). (Figure 2A) Enrichment of tri-methyl histone H3 Lys4 is shown for chromosome 8. Enriched sites of methylation are identified by the elevated number of sequencing reads for a given region of DNA. Enrichment of tri-methyl-histone H3 Lys4 methylation is shown for the active c-MYC (Figure 2B) and RPL30 (Figure 2C) genes.

CST would like to thank H. O'geen and P.J. Farnham of University of California, Davis in Davis, California for sharing their ChIP-Sequencing data.

SimpleChIP® Kit used with ChIP-Sequencing

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