Total抗体とリン酸化抗体のCSTジャパン株式会社

フローサートメトリー プロトコール (Flow)

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A 溶液および試薬

  1. 1×PBS: NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.44 g および KH2PO4 0.24 g を蒸留水 800 mL に溶解し、HCl で pH 7.4 に調整後、全量を 1 L にしてください。室温で保存してください。
  2. ホルムアルデヒド (メタノール不含)
  3. インキュベーションバッファー: BSA 0.5 g を 1×PBS 100 mL に溶解してください。4℃で保存してください。

B 固定

  1. 遠心により細胞を集め、上清を吸引除去してください。
  2. PBS 0.5-1 mL に細胞をかるく再懸濁し、ホルムアルデヒドを最終濃度が2-4%になるように加えてください。
  3. 37℃で10分間固定してください。
  4. チューブを1分間氷冷してください。
  5. 透過処理が必要ない細胞外染色の場合、ステップ D1 に進んでいただくか、細胞を PBS/0.1% アジ化ナトリウム 中、4℃で保存してください。細胞内染色の場合、透過処理のステップ C1 に進んでください。

C 透過化処理

  1. 予冷した細胞に、氷冷した 100% メタノールを緩やかにボルテックスしながら最終濃度が90%になるようにゆっくりと加え、細胞を透過化処理してください。あるいは、透過化処理前に固定液を取り除くため、遠心して細胞を沈殿させ、90%メタノールに再懸濁してください。
  2. 氷上で30分間冷却してください。
  3. 染色操作に進んでください。染色操作を続けて行わない場合は、細胞を90%メタノールに浸し、–20℃で保存してください。

D 染色

注意: コントロールにはご使用のモノクロナール抗体に適したアイソタイプ、もしくはポリクロナール抗体に適した種の IgG を使用してください。また、細胞数は血球計あるいはその他方法で測定してください。

  1. 各アッセイチューブに0.5-1×106個の細胞を分注してください (容量換算)。
  2. 各アッセイチューブにインキュベーションバッファー 2-3 mL を加え、遠心してすすいでください。繰り返してください。
  3. 各アッセイチューブにインキュベーションバッファー 100 μL を加え、細胞を再懸濁してください。
  4. インキュベーションバッファー中で、室温、10分間ブロッキングしてください。
  5. 各アッセイチューブに未標識、ビオチン標識、あるいは蛍光標識一次抗体を適切な希釈濃度で加えてください。(希釈率については、各抗体のデータシートを参照してください。)
  6. 室温で1時間インキュベートしてください。
  7. 前述2. と同様に、インキュベーションバッファーで遠心し、すすいでください。
  8. もし蛍光標識一次抗体を使用している場合、細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、フローサイトメーターで分析してください。未標識あるいはビオチン標識一次抗体を使用している場合は、ステップD9に進んでください。
  9. インキュベーションバッファーで推奨の希釈率に希釈した蛍光標識二次抗体＊あるいは蛍光標識アビジンに細胞を再懸濁してください。
  10. 室温で30分間インキュベートしてください。
  11. 前述2. と同様に、インキュベーションバッファーで遠心し、すすいでください。
  12. PBS 0.5 mL に細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで分析してください。DNA 染色をする場合は、ステップE1に進んでください。

E DNA 染色 （オプション）

  1. DNA dye (DRAQ5® #4084など) 0.5 mLに細胞を再懸濁してください。
  2. 室温で5分間以上インキュベートしてください。
  3. フローサイトメーターで分析してください。

推奨二次抗体：

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

Anti-Rat

(Alexa Fluor®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

フローサートメトリー プロトコール (Flow)

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