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免疫蛍光染色 プロトコール (IF)

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*重要項目: 製品がこのプロトコールで使用できるかどうかをデータシート第一面のAPPLICATIONSで確認して下さい。

A 溶液および試薬

注意: 溶液はMilli-Q®もしくは同等の精製水で調製してください。

  1. 10×PBS: NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 14.4 gおよびKH2PO4 2.4 gを蒸留水に溶解し、pH 7.4に調整後、全量を1 Lにしてください。
  2. 16%ホルムアルデヒド (メタノール不含、Polysciences社製、Cat#18814)。新しいホルムアルデヒドを使用してください。開封後は、暗所、4℃で保存し、使用時にPBSで希釈してください。
  3. キシレン
  4. エタノール (無水変性、病理学グレード、100%および95%)
  5. 蒸留水
  6. ブロッキングバッファー: 25 mLを用意する場合は、10×PBS 2.5 mL、二次抗体と同種の正常血清 (例: 正常ヤギ血清、正常ロバ血清) 1.25 mLと蒸留水21.25 mLをよく混ぜ合わせてください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 75 μLを加えてください。
  7. 抗体希釈バッファー: 40 mLを用意する場合は、10×PBS 4 mLを蒸留水36 mLに加えて混ぜ合わせてください。BSA 0.4 gを加え、溶解してください。スターラーで撹拌しながら、Triton X-100 (100%) 120 μLを加えてください。
  8. 10 mMクエン酸ナトリウムバッファー: 1 Lを用意する場合は、sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) 2.94 gを蒸留水に溶解し、pH 6.0に調整後、全量を1 Lにしてください。
  9. 1×PBS, high salt (0.4M) (high salt PBS): 10×PBS 100 mLを蒸留水 900 mLに加え、全量を1 Lにしてください。NaCl 23.38 gを加え、溶解してください。
  10. 蛍光標識二次抗体（推奨二次抗体）

注意: 一次抗体あるいは蛍光標識二次抗体を初めてご使用の際は、至適希釈率を決めるために予備実験を行ってください。

  1. Prolong® Gold Antifade Reagent (Invitrogen社製、Cat# P36930)

(Milli-Q®はMillipore Corporationの、Prolong ®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

B 試料作製

I. 培養細胞株 (IF-IC)

重要事項: 製品がIF-ICに使用できるかどうかをデータシートのAPPLICATIONSで確認して下さい。

注意: マルチウェルプレート、チェンバースライドあるいはカバースリップ上で直接細胞を培養、処理、固定および染色してください。

  1. PBSで細胞をかるくすすいでください。
  2. PBSを吸引除去し、細胞が2-3 mm浸る程の2-4%ホルムアルデヒド in PBSを加えてください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  1. 細胞を室温で15分間固定してください。
  2. 固定液を吸引除去し、PBSで各5分間、3回すすいでください。
  3. 免疫染色操作C に進んでください。

II. パラフィン切片 (IF-P)

重要事項: 製品がIF-Pに使用できるかどうかをデータシートのAPPLICATIONSで確認して下さい。

脱パラフィン/再水和:

  1. キシレンで切片を各5分間、3回インキュベートしてください。
  2. 100%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  3. 95%エタノールで切片を各10分間、2回インキュベートしてください。
  4. 蒸留水で切片を各5分間、2回すすいでください。

抗原賦活化:

  1. 室温の10 mMクエン酸ナトリウムバッファー (pH 6.0) にスライドを浸してください。
  2. 水浴あるいは電子レンジを用いてクエン酸ナトリウムバッファー中でスライドを煮沸し、その後95-99℃を10分間維持してください。
  3. 実験台上でスライドを30分間冷ましてください。
  4. 蒸留水で切片を各5分間、3回すすいでください。
  5. PBSで切片を5分間すすいでください。
  6. 免疫染色操作C に進んでください。

III. 凍結/クリオスタット切片 (IF-F)

重要事項: 製品がIF-Fに使用できるかどうかをデータシートのAPPLICATIONSで確認して下さい。

注意: 作製したての凍結/未固定切片は、シグナルエピトープを保存するために下記方法で直ちに2-4%ホルムアルデヒドで固定してください。

  1. 2-4%ホルムアルデヒド in PBSで切片を覆ってください。

注意: ホルムアルデヒドは毒性がありますので、ドラフト内でのみ使用してください。

  1. 切片を室温で15分間固定してください。
  2. PBSでスライドを各5分間、3回すすいでください。

C 免疫染色

注意: 乾燥と蛍光色素の退色防止のため、遮光湿潤箱中、または蓋付きのディッシュ/プレート中で行うように指定がない限り、免疫染色の全てのインキュベーションは室温で行ってください。

  1. ブロッキングバッファーで試料を60分間ブロッキングしてください。
  2. ブロッキングしている間に、一次抗体を抗体希釈バッファーで、データシートに示されている通りに希釈してください。
  3. ブロッキング液を吸引除去し、希釈した一次抗体をアプライしてください。

注意: 二重染色用に、抗体希釈バッファーで適宜希釈した一次抗体の混合液を調製してください。

  1. 4℃で一晩インキュベートしてください。
  2. PBSで各5分間、3回すすいでください。

オプション: バックグラウンドの染色を少なくしたい場合は、2回目と3回目のPBS洗浄の間にhigh salt PBSで2分間すすいでください。ただし、このすすぎにより特異的染色が弱くなる抗体がありますのでご注意ください。

注意: Alexa Fluor®蛍光色素で直接標識された一次抗体を使用する場合は、ステップC8.に進んでください。

  1. 抗体希釈バッファーで希釈した蛍光標識二次抗体*を、暗室、室温で1-2時間インキュベートしてください。

注意: 二重染色用に、抗体希釈バッファーで適宜希釈した蛍光標識二次抗体の混合液を調製してください。

  1. ステップC5.と同様に、PBS/high salt PBSですすいでください。
  2. スライド上の細胞にProlong® Gold Antifade Reagentを添加し、カバースリップで覆ってください。あるいは、マルチウェルプレート上の細胞を覆うのに十分なProlong® Gold Antifade Reagentをアプライしてください。
  3. カバースリップの縁周りにマニキュア液を塗ってスライドを密封してください。
  4. 蛍光色素の最良の結果を得るために、直ちに適切な励起波長で染色像を観察してください。スライドを長期保存する際は、4℃、暗所で、フラットに保存してください。

推奨二次抗体：

Anti-Rabbit

Anti-Mouse

Anti-Rat

(Alexa Fluor®はMolecular Probes, Inc.の登録商標です。)

posted November 2006

revised February 2008

免疫蛍光染色 プロトコール (IF)

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